溫硯子 張 平 黃建榮

（中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510275）

草履蟲（Paramecium）是原生動物門纖毛綱的代表物種，具有易分離、易培養(yǎng)的特點，是生物學(xué)實驗教學(xué)常用的實驗材料。碳酸銀染色是一種被廣泛應(yīng)用于纖毛蟲分類學(xué)、細胞遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和細胞毒理學(xué)等研究領(lǐng)域的技術(shù)。該染色方法主要是基于Fernandez-Galiano提出的試劑配方和操作流程而進行設(shè)計［1-2］。碳酸銀染色法可以清晰染色草履蟲的細胞核、表面纖毛基粒和皮下纖維系統(tǒng)；與其他常用的纖毛蟲染色方法相比，具有步驟簡單、用時少的特點，因此利用碳酸銀染色顯示草履蟲的結(jié)構(gòu)在實驗教學(xué)中被廣泛采用［3］。但是傳統(tǒng)的碳酸銀染色方法在草履蟲染色實驗教學(xué)中效果常常不穩(wěn)定，例如，樣品液、固定液和染色液加樣是通過計算滴管的液滴數(shù)依比例混合，不同學(xué)生對滴管的使用力度有偏差，導(dǎo)致染色效果參差不一，有些學(xué)生甚至多次操作也不能讓草履蟲成功著色。另外，傳統(tǒng)的染色流程是根據(jù)目測反應(yīng)液變成“棕色”或“巧克力色”而終止反應(yīng)，這種描述性的判斷對于初學(xué)者來說很難準確把握，著色太淺或太深的情況在課堂中很常見，妨礙后續(xù)對草履蟲微觀結(jié)構(gòu)的觀察，影響正常教學(xué)進程。同時，傳統(tǒng)方法多采用加入硫代硫酸鈉終止染色反應(yīng)，而在課堂中常見學(xué)生在鏡檢后才發(fā)現(xiàn)草履蟲染色不夠，卻因加入硫代硫酸鈉后不能讓反應(yīng)液再進一步加熱染色，導(dǎo)致學(xué)生不斷重復(fù)操作，無法在有限的課堂時間內(nèi)完成實驗。本文針對草履蟲碳酸銀染色實驗教學(xué)中發(fā)生的常見問題進行探索，優(yōu)化了染色配方、細化了操作流程，使其更適用于教學(xué)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

試劑：硝酸銀、碳酸鈉、氨水、吡啶、蒸餾水、甲醛、草履蟲分離液或草履蟲培養(yǎng)液。

器材：天平、燒杯、量筒、玻璃棒、移液器（100 ～1 000 μL）及吸頭、5 mL 玻璃試管和水浴鍋。

1.2 實驗方法

1）染色液配制（教師準備）：染液現(xiàn)配現(xiàn)用。

①Rio-Hortega碳酸銀溶液：5 mL 10%硝酸銀溶液+15 mL 5%碳酸鈉溶液，混勻后逐滴加入氨水至沉淀完全溶解，蒸餾水稀釋至75 mL；

②Fernandez-Galiano染色液 （不加蛋白胨）：75 mL Rio-Hortega溶液+37.5 mL吡啶混合，蒸餾水稀釋至537.5 mL。

2）草履蟲碳酸銀染色（學(xué)生操作）：

①用移液器加入 200 μL草履蟲培養(yǎng)液于5 mL玻璃試管中，隨后加入200 μL 4%甲醛固定，輕搖混勻后靜置1 min；

②加入200 μL已配置好的Fernandez-Galiano染色液，輕搖混勻；

③60℃水浴3 min，在此過程中輕搖試管保證染色均勻；

④加入200 μL冷蒸餾水，終止反應(yīng)；

⑤吸取蟲體鏡檢，為保證觀察效果，盡量在反應(yīng)結(jié)束后60 min內(nèi)取樣鏡檢。

2 操作步驟注意事項和說明

2.1 染色液配制注意事項 由于硝酸銀等試劑化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，長時間保存容易變質(zhì)，因此在染液配置前務(wù)必要確保所用試劑未變性。傳統(tǒng)的Fernandez-Galiano染液有添加蛋白胨，而本研究發(fā)現(xiàn)不添加蛋白胨的染液在保證細胞核、纖毛基粒等結(jié)構(gòu)被清晰染色的情況下，更不容易產(chǎn)生過度染色（圖1），更適用于實驗教學(xué)環(huán)境，所以改良的染液中不再添加蛋白胨。

圖1 草履蟲經(jīng)Fernandez-Galiano染液染色

2.2 實驗操作注意事項

1）為了避免因使用滴管力度不均而造成的染色效果失敗，改用移液器對加樣體積進行準確定量，確保每個學(xué)生在有限的課堂教學(xué)時間內(nèi)能將草履蟲成功染色。

2）傳統(tǒng)的操作方法是利用反應(yīng)液的顏色進行主觀判斷決定是否終止反應(yīng)，這對于初學(xué)者而言很難準確把握，課堂中大部分學(xué)生都會出現(xiàn)染色不夠或染色過深的情況。經(jīng)過反復(fù)實驗探索，發(fā)現(xiàn)依照所改良的試劑配方和操作步驟，反應(yīng)3 min即可得到最佳的染色效果。

3）由于教學(xué)實驗結(jié)果無需長久保存，建議用冷蒸餾水替代硫代硫酸鈉進行終止反應(yīng)。與化學(xué)終止法不同，冷卻終止反應(yīng)法只是通過降低溫度終止反應(yīng)，反應(yīng)液中的化學(xué)試劑仍未變性，因此在發(fā)現(xiàn)草履蟲著色不充分的情況下，再次加熱反應(yīng)仍然可讓草履蟲著色加深，避免學(xué)生在有限的課堂時間內(nèi)重復(fù)操作。但是，這種非化學(xué)變性的方法存在不能讓反應(yīng)徹底終止的缺陷，為避免長久放置導(dǎo)致染色過深，應(yīng)在反應(yīng)結(jié)束后60 min內(nèi)取樣觀察。

3 總結(jié)

基于Fernandez-Galiano染液的碳酸銀染色方法，可清晰顯示草履蟲的纖毛圖式。由于傳統(tǒng)配方和操作方法在課堂教學(xué)應(yīng)用中表現(xiàn)不穩(wěn)定，影響了教學(xué)效果，因此在本研究中，通過修改染色液配方、細化實驗操作步驟以獲得更好的染色效果，保證實驗教學(xué)質(zhì)量。該方法目前在課堂教學(xué)中已獲得良好的效果。