祁惠芳 程子良 牛亞勝 孔維寶**

（1西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070 2天水農(nóng)業(yè)學(xué)校 甘肅天水 741400）

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

近年來(lái)，涉農(nóng)類中職學(xué)校為突出學(xué)生的實(shí)訓(xùn)操作，開設(shè)了《生物應(yīng)用技術(shù)》課程，該課程以就業(yè)為導(dǎo)向，注重學(xué)生技術(shù)技能的培養(yǎng)。然而，目前大多數(shù)學(xué)校使用的教材，均參考以義務(wù)教育為基礎(chǔ)的教材，涉及的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容大多以生物學(xué)基礎(chǔ)研究為主，例如顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)、探究光合作用條件、觀察玉米糯性和非糯性花粉粒遇碘的顏色變化實(shí)驗(yàn)等，未能體現(xiàn)與職業(yè)教育導(dǎo)向相關(guān)的應(yīng)用知識(shí)的學(xué)習(xí)。因此，教學(xué)內(nèi)容與實(shí)際生活脫軌，導(dǎo)致中職學(xué)生這一特殊群體對(duì)學(xué)習(xí)的生物學(xué)興趣不高。

為了在教學(xué)中讓中職學(xué)生掌握扎實(shí)的微生物學(xué)無(wú)菌操作知識(shí)，且與未來(lái)就業(yè)接軌，筆者以“納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆制品”實(shí)驗(yàn)作為教學(xué)內(nèi)容，提高學(xué)生學(xué)習(xí)《生物應(yīng)用技術(shù)》課程的興趣，巧妙地使學(xué)生掌握原本枯燥的無(wú)菌操作、培養(yǎng)基制作、菌種活化、發(fā)酵制品制作等相關(guān)的理論知識(shí)和實(shí)踐技能，增加學(xué)習(xí)過(guò)程的趣味性。該實(shí)驗(yàn)以納豆為原材料，綠色環(huán)保、容易獲取、營(yíng)養(yǎng)豐富，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)、易于學(xué)生掌握。發(fā)酵后的產(chǎn)品可將大豆中不溶解性蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘鞍撞a(chǎn)生氨基酸，同時(shí)成品具有預(yù)防腸道疾病、骨質(zhì)疏松及溶膠血栓的作用［1］。

教育與實(shí)踐行動(dòng)相結(jié)合，既能激發(fā)中職學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，真正做到在“做事里求學(xué)問(wèn)”［2］，又能讓學(xué)生獲得成就感與滿足感。中職學(xué)校的核心任務(wù)是培養(yǎng)滿足社會(huì)發(fā)展和企業(yè)需求的專業(yè)化應(yīng)用型技能人才。學(xué)習(xí)納豆的制作方法其實(shí)是掌握了一項(xiàng)職業(yè)技能，可增加學(xué)生未來(lái)就業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，一定程度上緩解中職學(xué)校重理論教學(xué)、輕實(shí)踐操作的問(wèn)題，真正掌握生產(chǎn)實(shí)踐過(guò)程中所需的專業(yè)職業(yè)技能。因此，本實(shí)驗(yàn)是中職學(xué)生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的理想內(nèi)容之一。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容

本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)分4課時(shí)完成。課程開始前，教師根據(jù)全班學(xué)生情況進(jìn)行分組，每組6人，小組成員各自擅長(zhǎng)之處不同，組內(nèi)不設(shè)置小組長(zhǎng)，完成任務(wù)靠小組成員共同討論。教師給各小組分發(fā)實(shí)驗(yàn)流程單和實(shí)驗(yàn)報(bào)告單。第1課時(shí)：納豆成品展示與芽孢桿菌菌種活化實(shí)驗(yàn)。教師展示成品納豆并讓學(xué)生品嘗，指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行菌種活化實(shí)驗(yàn)；主要目的是使學(xué)生掌握無(wú)菌操作技術(shù)、培養(yǎng)基和種子液的制作方法；這部分實(shí)驗(yàn)步驟較多，對(duì)學(xué)生的操作細(xì)節(jié)的要求較嚴(yán)格，要求各小組學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行錄像，用于后續(xù)討論。第2課時(shí)：制作納豆。主要目的是培養(yǎng)學(xué)生專業(yè)職業(yè)技能，在納豆制作的過(guò)程中加深對(duì)生物基本操作的認(rèn)識(shí)，掌握納豆制作工藝。第3課時(shí)：納豆成品的感官評(píng)定與理化指標(biāo)檢驗(yàn)。主要目的是判斷學(xué)生制作的納豆是否達(dá)到SB／T 10528-2009納豆商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，是否可食用。第4課時(shí)，成果展示并全班評(píng)價(jià)。各小組學(xué)生展示成果和播放錄像，講解實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和目的。

2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1）材料與試劑：黃豆、納豆芽孢桿菌（Bacillusnatto）、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、0.01 mol／L 和6 mol／L NaOH、0.01 mol／L 和 6 mol／L HCl、海沙。

2）儀器與器具：PYL-45恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、恒溫振蕩器、SW-CJ-2FD超凈臺(tái)、YXQLS-7 5SII立式蒸汽滅菌鍋、冰箱、移液器、真空干燥箱、pH試紙、培養(yǎng)皿、試管、三角瓶。

2.2 實(shí)驗(yàn)操作流程 本次實(shí)驗(yàn)操作流程主要分為3個(gè)部分：第1部分，納豆芽孢桿菌菌種活化與種子液的制備；第2部分，納豆的制作過(guò)程（圖1）；第3部分，納豆成品的感官評(píng)定及理化指標(biāo)測(cè)定。

表 1 感官評(píng)定［5］與理化指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)［6］

圖1 納豆的制作流程

2.2.1 納豆芽孢桿菌種活化 按照培養(yǎng)基的配方配制培養(yǎng)基：蛋白胨 1%、牛肉膏 0.3%、NaCl 0.5%、葡萄糖 0.5%、酵母膏 0.5%、瓊脂粉 1.8%（以上均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［3］。待培養(yǎng)基滅菌并冷卻至42℃時(shí)，倒平板；將保存的納豆芽孢桿菌接種至培養(yǎng)基中。納豆芽孢桿菌活化完成后，使用接種環(huán)刮下菌孢并用無(wú)菌水沖洗，接入裝有一定量液體培養(yǎng)基的試管中；在30℃條件下，180 r／min搖床培養(yǎng)24 h制得種子液。

2.2.2 納豆成品制作 將大豆清洗干凈后，用水浸泡8～15 h，直至大豆體積膨脹為原來(lái)的2倍。將泡好的大豆在121°C條件下，進(jìn)行高溫高壓滅菌15 min，大豆在手中可捏碎為最佳；然后在無(wú)菌環(huán)境下將滅菌的大豆移入發(fā)酵籠屜中冷卻，冷卻時(shí)表面需覆一層紗布；冷卻至室溫后，將準(zhǔn)備好的種子液按8%～10%接種量淋至大豆表面，用無(wú)菌鏟攪拌均勻；將接種的大豆置于42℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15～18 h，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵完成后，揭去籠屜表面的紗布，豆子將呈現(xiàn)灰白色，略有納豆的清香；最后將發(fā)酵的納豆置于4℃的冰箱中后熟24 h。

2.2.3 納豆成品感官評(píng)定和理化指標(biāo)測(cè)定

1）感官評(píng)定。表1所示的是現(xiàn)行有效的SB／T 10528-2009對(duì)納豆的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)；使用目測(cè)、口嘗及嗅覺等方式對(duì)納豆制品進(jìn)行感官評(píng)定；學(xué)生以小組為單位分別對(duì)不同組別的成品進(jìn)行打分，判斷是否符合標(biāo)準(zhǔn)［4］（表 1）。

2）理化指標(biāo)測(cè)定。

水分測(cè)定：按照GB／T 5009.3要求，利用減壓干燥法，使用已恒重的稱量瓶稱取10 g試樣并用刀片切碎，置于真空干燥箱內(nèi)，干燥箱連接水泵。將干燥箱的空氣抽出，壓力控制在40～53 kPa，溫度加熱至（60±5）℃。關(guān)閉真空泵上的活塞，停止抽氣，經(jīng)4 h后，打開活塞使空氣緩緩進(jìn)入干燥箱，待壓力恢復(fù)正常后再打開，取出稱量瓶，放入干燥器0.5 h后稱量，重復(fù)以上操作至恒重。按照下述公式計(jì)算水分含量，含量；m1：稱量瓶和試樣的質(zhì)量；m2：稱量瓶和試樣干燥后的質(zhì)量；m3：稱量瓶的質(zhì)量），結(jié)果與表1的標(biāo)準(zhǔn)范圍進(jìn)行比較，判斷是否符合食用要求［5］。

氨基酸態(tài)氮：按照GB／T 5009.39要求，利用甲醛值法測(cè)定氨基酸態(tài)氮值。將樣品粉碎研磨后吸取5 mL試樣于100 mL容量瓶中定容；混勻后吸取20 mL至于200 mL燒杯中，加60 mL水，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol／L NaOH滴定至酸度計(jì)指示pH值為8.2，記錄NaOH滴定體積；然后加入10 mL甲醛溶液混勻，繼續(xù)用 0.05 mol／L NaOH滴定至酸度計(jì)指示pH值為9.2，記錄消耗的 NaOH 體積；取 80 mL水，用 0.05 mol／L NaOH調(diào)節(jié)pH值為9.2，同時(shí)做試劑空白對(duì)照。使用下述公式計(jì)算氨基酸態(tài)氮，100%（X：試樣中氨基酸態(tài)氮含量；V1：試樣稀釋液消耗NaOH的滴定體積；V2：空白試驗(yàn)消耗NaOH的滴定體積；V3：試樣稀釋液取用量；c：NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度）。計(jì)算結(jié)果與表1進(jìn)行比較，判斷是否符合標(biāo)準(zhǔn)［6］。

2.2.4 實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)

1）蛋白胨易吸收水份，在稱量時(shí)用玻璃棒快速挑取，用熱水?dāng)嚢枞诨蠓湃霟?/p>

2）每次調(diào)節(jié)較小幅度的pH值，以免回調(diào)影響培養(yǎng)基內(nèi)的離子濃度，直至pH值范圍控制在7.4～7.6內(nèi)。

3）使用蒸汽滅菌鍋將制作好的培養(yǎng)基在壓強(qiáng)0.1 MPa、溫度121℃條件下，滅菌20 min。

4）種子液接種至大豆表面時(shí)，一定要在無(wú)菌環(huán)境下操作，防止雜菌污染。

5）浸泡大豆時(shí)，每隔3 h更換浸泡水，防止大豆進(jìn)行無(wú)氧呼吸產(chǎn)生酸味。

6）大豆的蒸煮程度以用手可輕輕捏碎為最佳。研究表明，隨著碾碎程度的加大，氨基酸態(tài)氮和粘多糖含量顯著增加［7］，可使大豆發(fā)酵更加充分。

7）將種子液接種至大豆后，在 42℃下發(fā)酵15～18 h，然后4℃后熟24 h。若過(guò)度發(fā)酵，會(huì)破壞納豆芽孢桿菌結(jié)構(gòu)，且容易引起其他雜菌滋生。

2.3 實(shí)驗(yàn)報(bào)告單 教師將實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)成探究性問(wèn)題，并制作實(shí)驗(yàn)報(bào)告單分發(fā)給學(xué)生，待實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行回收。旨在培養(yǎng)學(xué)生獨(dú)立思考的能力，學(xué)生通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作與現(xiàn)象觀察，明白實(shí)驗(yàn)原理和理解實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告單如表2所示。

表2 “納豆芽孢桿菌發(fā)酵納豆制品”實(shí)驗(yàn)報(bào)告單

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論 整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程較簡(jiǎn)單，只要嚴(yán)格遵照操作步驟，注意實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作即可，全程一定要明確無(wú)菌操作意識(shí)。學(xué)生針對(duì)自己小組出現(xiàn)的問(wèn)題認(rèn)真思考，展開討論，部分小組制作的納豆成品由于制作過(guò)程中雜菌滋生導(dǎo)致氨味過(guò)于強(qiáng)烈；有些小組制作的納豆有惡臭味，主要原因是在大豆浸泡過(guò)程中沒有及時(shí)更換浸泡水；個(gè)別小組的成品雖然表面粘稠品相很好，但口味略發(fā)苦，導(dǎo)致這種不良?xì)馕懂a(chǎn)生的原因主要是大豆在發(fā)酵時(shí)透氣性不好，因此發(fā)酵時(shí)一定要在保證適宜濕度的前提下合理通風(fēng)。

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)總結(jié)

本次實(shí)驗(yàn)的靈感來(lái)自于中職 《生物應(yīng)用技術(shù)》，實(shí)驗(yàn)利用納豆芽孢桿菌制作納豆，培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的興趣，鍛煉專業(yè)職業(yè)技能。該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生初步了解并學(xué)習(xí)了無(wú)菌操作技術(shù)、微生物純化、培養(yǎng)基制備、種子液配制、發(fā)酵條件控制、產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)讓學(xué)生掌握納豆的制作工藝，為后續(xù)開展生物學(xué)應(yīng)用技術(shù)課程的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)。

生物學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)科學(xué)，對(duì)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能要求較高，實(shí)驗(yàn)教學(xué)方式不應(yīng)該是教師 “講解”，學(xué)生被動(dòng)“接受”［3］。第4課時(shí)加入視頻展示和評(píng)價(jià)環(huán)節(jié)，其實(shí)是讓學(xué)生在“做中學(xué)”，觀看自己的實(shí)驗(yàn)，可清楚地看到實(shí)驗(yàn)中錯(cuò)誤的操作。微生物操作技術(shù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)操作要求十分嚴(yán)格，每個(gè)操作要點(diǎn)都應(yīng)該熟記于心，不小心雜菌侵染可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗，因此教師和全體學(xué)生共同評(píng)價(jià)，有助于學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)的把控更加完善，扎實(shí)掌握微生物實(shí)踐技能。然而，單純地掌握技能是不夠的，還需要學(xué)生在工作實(shí)踐中靈活應(yīng)用，不斷強(qiáng)化職業(yè)技能，為未來(lái)的就業(yè)提升競(jìng)爭(zhēng)力。當(dāng)下將微生物應(yīng)用在食品、制藥和生物領(lǐng)域十分廣泛，本節(jié)實(shí)驗(yàn)就是微生物在食品行業(yè)的應(yīng)用，教學(xué)開始時(shí)讓學(xué)生品嘗納豆成品，從味道微甜、口感粘稠的納豆中激發(fā)學(xué)生的求知欲，納豆為什么表面會(huì)抽絲？味道為什么會(huì)發(fā)甜？什么菌種發(fā)酵才能達(dá)到這種效果？充分發(fā)揮學(xué)生的自主性、主動(dòng)性和創(chuàng)造性，在學(xué)習(xí)知識(shí)、掌握職業(yè)技能的同時(shí)，培養(yǎng)學(xué)生的生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。