李賓 王忠民 陳志軍 董成來 曹克鑫 甘紹印 陶義鵬

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外一科（河南新鄉(xiāng) 453100）

食管癌的發(fā)病率、死亡率已經(jīng)位居我國的第五位、第四位[1]，手術(shù)仍然是食管癌的首選治療方法，而中晚期食管癌患者術(shù)后的5年生存率卻僅為30%[2]。研究發(fā)現(xiàn)，同一基因不同的表達(dá)水平和（或）不同基因的表達(dá)都使食管癌在生物學(xué)特性上面發(fā)生改變[3]。目前已經(jīng)證實(shí)，TOP2A基因位于17q12-21，它編碼的人類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα（topoismeraseⅡalpha，TOPⅡα），是一種依賴ATP的水解酶和合成酶，在細(xì)胞多種生物學(xué)行為中起著重要作用，包括DNA復(fù)制、染色體分離、染色質(zhì)濃縮及基因表達(dá)等[4]。目前已經(jīng)證實(shí)，它的異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌、胃癌、乳腺癌等多種實(shí)體腫瘤密切相關(guān)，且均促進(jìn)了腫瘤組織的增殖、轉(zhuǎn)移[5-7]。但關(guān)于TOP2A在食管癌中的表達(dá)情況鮮有報(bào)道，因此，探索TOP2A在食管鱗癌中的表達(dá)情況，以及其與食管癌患者的臨床預(yù)后情況，具有非常重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年9月至2013年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科行“食管癌根治術(shù)”手術(shù)切除的蠟塊組織標(biāo)本126例，將雙源癌、已接受術(shù)前放化療的患者剔除，共28例，觀察入組98例患者建立資料庫，同時(shí)選取55例癌旁組織（距癌組織切緣＞5 cm）作為對照組，所選取術(shù)后組織標(biāo)本均經(jīng)我院病理科2位專家檢查確診為鱗癌，按照AJCC及UICC聯(lián)合制訂的惡性腫瘤TNM分期（第8版）食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)對標(biāo)本進(jìn)行TNM分期。從性別、年齡、腫瘤位置、病變長度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期等7個(gè)特征進(jìn)行分析。

1.2 患者隨訪查閱我院病案室患者的相關(guān)資料，根據(jù)入院病歷基本信息及聯(lián)系方式，主要通過電話和門診隨訪進(jìn)行隨訪。其中，聯(lián)系方式發(fā)生變化的，根據(jù)病歷地址入戶隨訪，更新聯(lián)系方式后繼續(xù)電話隨訪。隨訪頻率為每半年一次，直到終末事件（死亡）為止。本研究隨訪起止時(shí)間為2016年3月，截止時(shí)間為2018年5月，共獲取有明確生存狀況的患者92例，隨訪成功率為94%。生存日期以手術(shù)日期到隨訪日期確定為準(zhǔn)。

1.3 主要試劑兔抗人TOP2A單克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，即用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法采用免疫組織化學(xué)法檢測TOP2A蛋白在食管鱗癌中的表達(dá)，具體如下：將組織標(biāo)本從固定液中取出，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，制備成石蠟切片，按SP試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，一抗工作液濃度以1∶200稀釋（即將TOP2A原液稀釋200倍備用），用0.1 mmol/L的PBS液代替TOP2A一抗作為陰性對照。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水透明后，樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 結(jié)果判讀以細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。TOP2A陽性信號定位于細(xì)胞質(zhì)中。根據(jù)臨床病理學(xué)免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞陽性及其程度由細(xì)胞率和細(xì)胞染色強(qiáng)度共同決定[8]。視野標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)視野不低于200個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)性的對5個(gè)視野進(jìn)行觀察，判定標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；腫瘤細(xì)胞顯色程度：＜10%定為0分，10%～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分；二者總積分0～3分為陰性，4～5分為（+），6～7分為（++），8分以上為（+++），其中陽性表達(dá)是+～+++。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料分析使用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meie（K-M）法繪制生存曲線并計(jì)算生存率，采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，采用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A蛋白在食管鱗癌和癌旁組織中的表達(dá)情況食管鱗癌組織中TOP2A蛋白表達(dá)陽性率為47.9%（47/98），在正常食管黏膜組織中表達(dá)陽性率為23.6%（13/55）。癌組織中TOP2A表達(dá)高于癌旁組織（χ2=12.085，P=0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 TOP2A在食管癌及癌旁組織中的表達(dá)（100×）Fig.1 Expression of TOP2A in esophageal carcinoma and paracancerous tissues

表1 TOP2A在食管鱗癌和癌旁組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of TOP2A in esophageal squamous cellcarcinoma and paracancerous tissue 例（%）

2.2 TOP2A的表達(dá)與食管癌臨床病理特征關(guān)系采用行×列表卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：性別、年齡、腫瘤位置與TOP2A的表達(dá)不具有相關(guān)性，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.334、1.142、1.134，P＞ 0.05）；而病變長度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期與TOP2A的表達(dá)具有相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.833、8.942、5.749、9.343；P＜0.05）。見表2。

2.3 TOP2A表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系對98例食管鱗癌患者進(jìn)行回顧性分析，采用Kaplan-Meie（K-M）法計(jì)算生存率，并用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析。TOP2A表達(dá)陽性患者的5年生存率為19%，而TOP2A表達(dá)陰性患者的5年生存率為25%；本研究顯示：性別、年齡及腫瘤位置對食管癌患者的臨床預(yù)后無顯著影響；而病變長度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期及TOP2A表達(dá)均可以對食管癌患者的生存率產(chǎn)生顯著的影響（P＜0.05，表3）。進(jìn)一步將相關(guān)變量納入COX回歸模型，進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，病變長度不是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；而分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期及TOP2A表達(dá)均是影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。TOP2A表達(dá)情況對生存率的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.014），是影響食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。即TOP2A陽性表達(dá)的比陰性表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)高1.124倍。見表4。

表2 113例食管癌臨床病理特征與TOP2A的表達(dá)與關(guān)系Tab.2 Relationship between clinicopathological features and expression of TOP2A in 113 cases of esophageal cancer例

表3 食管癌患者預(yù)后單因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognosis in patients with esophageal cancer

3 討論

食管癌的病因尚未完全明了，有研究指出，其與原癌基因的激活、抑癌基因的失活、調(diào)節(jié)DNA的修復(fù)等分子生物學(xué)行為密切相關(guān)。TOP2A編碼的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ蛋白（TOPⅡ）是一種基本的核酶，可以催化DNA雙鏈超螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂和連接反應(yīng)，并與細(xì)胞分裂、有絲分裂期染色體配對、染色體分離、基因重組和轉(zhuǎn)錄及DNA損傷與修復(fù)有密切關(guān)系。TOP2A在食管癌、肝癌、胃癌及大腸癌等多種實(shí)體腫瘤中的表達(dá)明顯高于相鄰的正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的增殖水平呈現(xiàn)正相關(guān)性[9-11]。另有研究表明，腫瘤中高表達(dá)的TOP2A與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[12]。

表4 食管癌患者預(yù)后多因素COX分析Tab.4 COX analysis of prognostic factors in patients with esophageal cancer

本研究采用免疫組織化學(xué)（SP）染色檢測了TOP2A的蛋白在食管鱗癌中表達(dá)情況，得出了類似的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)TOP2A在食管癌組織中的蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，還發(fā)現(xiàn)在有淋巴轉(zhuǎn)移的食管癌組織中，TOP2A蛋白的陽性率為56.8%，而無淋巴轉(zhuǎn)移的食管癌組織中TOP2A的陽性率僅為33.3%。在對98例食管癌患者的病理特征分析中發(fā)現(xiàn)，TOP2A的表達(dá)水平與性別、年齡無明顯相關(guān)性；而與浸潤深度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期有明顯的相關(guān)性。外膜浸潤、低分化、淋巴轉(zhuǎn)移及較晚的臨床分期等均提示腫瘤具有更大、更強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為，而TOP2A在這些病理特征中呈現(xiàn)的更高表達(dá)，提示著TOP2A有望在臨床上成為預(yù)測腫瘤預(yù)后的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)。

食管癌的預(yù)后相關(guān)因素較多，目前大多研究認(rèn)為組織學(xué)類型、分化程度、病變長度、浸潤深度及腫瘤位置等與腫瘤的臨床預(yù)后密切相關(guān)[13-16]；TAKEMURA等[17]的研究發(fā)現(xiàn)患者的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、脈管轉(zhuǎn)移是獨(dú)立的預(yù)后因素。本研究對92例食管癌的預(yù)后相關(guān)因素進(jìn)行分析，對其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，TOP2A表達(dá)、病變長度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期均對食管癌患者的5年生存率產(chǎn)生顯著的影響。本研究進(jìn)一步將TOP2A表達(dá)、病變長度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，結(jié)果顯示TOP2A表達(dá)、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期是影響食管癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在患者遠(yuǎn)期預(yù)后評估中有重要的臨床意義。

綜上所述，TOP2A在食管癌組織中的蛋白表達(dá)明顯高于癌旁組織，且它的高表達(dá)與病變長度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期等病理特征密切相關(guān)，這為其成為預(yù)測腫瘤預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。而對92例患者5年生存情況進(jìn)行回顧性分析，將TOP2A表達(dá)、病變長度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期等變量因素納入COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，結(jié)果顯示TOP2A表達(dá)陽性的患者比陰性患者的風(fēng)險(xiǎn)高1.124倍，這為TOP2A成為預(yù)測腫瘤預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)提供了臨床依據(jù)。即通過對TOP2A表達(dá)情況的分析，可判定患者的臨床預(yù)后。同時(shí)，本研究存在一定的局限性，對于TOP2A在淋巴結(jié)中的表達(dá)情況，它的高表達(dá)是否促進(jìn)了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及不同區(qū)域轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的表達(dá)強(qiáng)度等問題還需進(jìn)一步深入的研究。