胡文兵 陶澤璋 費(fèi)新雄 顧磊 朱蘇謹(jǐn) 陳軍

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北黃石 435000）；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院（武漢 430060）

S100蛋白是一種低分子量的酸性鈣結(jié)合蛋白，與鈣離子結(jié)合后可以參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[1]。S100A8和S100A9均為S100蛋白質(zhì)家族成員，在胞質(zhì)中通過(guò)相互特異性結(jié)合形成二聚體復(fù)合物S100A8/A9，該二聚體對(duì)Ca2+濃度具有一定的依賴性，且具有一定的細(xì)胞或組織特異性，可以調(diào)節(jié)多種蛋白的表達(dá)及活性，對(duì)細(xì)胞遷移、細(xì)胞成熟、細(xì)胞功能表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程均具有明顯調(diào)控效果[2]。近年來(lái)的研究[3]發(fā)現(xiàn)S100A8和S100A9在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展中起一定作用，尤其是可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)免疫抑制。

S100A8和S100A9在不同的腫瘤細(xì)胞中具有不同的表達(dá)和功能，在鼻咽癌中S100A8和S100A9的表達(dá)也高于正常組織[4]，但這兩種蛋白在鼻咽癌中的作用尚不完全清楚。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)鼻咽癌組織中S100A8、S100A9蛋白的表達(dá)，并分析與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性來(lái)推測(cè)其在鼻咽癌中的功能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2008年1月至2011年12月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院、黃石市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科行組織活檢首次診斷的92例鼻咽癌患者的癌組織標(biāo)本。其中男58例，女34例，平均年齡為（50.7±9.4）歲；癌組織分化程度為低分化或未分化的患者74例，中高分化者18例；根據(jù)中國(guó)鼻咽癌2008年分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期的患者為48例，Ⅲ～Ⅳ期44例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。92例慢性鼻咽炎患者中男55例，女37例，平均年齡（51.4±10.1）歲。兩組患者的性別、年齡、體質(zhì)量等一般情況數(shù)據(jù)之間相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)黃石市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。

表1 患者基本資料Tab.1 The basic information of patients ±s

表1 患者基本資料Tab.1 The basic information of patients ±s

項(xiàng)目鼻咽癌組鼻咽炎組χ2/t值P值例數(shù)92 92性別（例）男58 55 0.210 0.647女34 37年齡（歲）50.7±9.4 51.4±0.1 0.178 0.859體質(zhì)量（kg）58.5±5.6 59.2±6.3 0.616 0.539

1.2 病例納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診，分期明確；（2）入院前未接受過(guò)放療、化療及其他抗腫瘤治療；（3）KPS評(píng)分≥70；（4）有完整的臨床病理資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他器官腫瘤病史者；（2）合并嚴(yán)重的心、腦、肝、腎等器官原發(fā)性疾病者；（3）妊娠或哺乳期女性；（4）不配合隨訪者。

1.3 免疫組化檢測(cè)鼻咽癌組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟。將組織切片置于沸騰的檸檬酸緩沖液（pH 6.0）中，微波加熱15 min修復(fù)抗原，37℃下在3%過(guò)氧化氫去離子水中孵化15 min。添加一抗溶液（兔抗人S100A8和S100A9單克隆抗體），在37和4℃孵化60 min，過(guò)夜。然后加入二抗溶液（SP試劑盒，Abcam公司，英國(guó)），37℃孵化45 min。加入鏈霉菌抗生物素過(guò)氧化物酶，37℃孵育45 min，BAD染色，蘇木精染色。上述陽(yáng)性組織切片用于陽(yáng)性對(duì)照，緩沖液代替一抗溶液用于陰性對(duì)照。結(jié)果評(píng)價(jià)：S100A8和S100A9的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。采用配對(duì)評(píng)分和半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)結(jié)果。評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分率，以染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率的總分作為陽(yáng)性表達(dá)的判斷。結(jié)果的判讀參考陶曉峰等[5]的標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色強(qiáng)度評(píng)分為：無(wú)色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕黃色3分。（2）陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞0分＜6%，1分6%～25%，2分26%～50%，3分51% ～75%，4分＞75%。（3）上述兩個(gè)評(píng)分相加：陰性表達(dá)（-）0～1分，弱陽(yáng)性表達(dá)（+）2～3分，中度陽(yáng)性表達(dá)（++）4～5分，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（+++）6～7分。免疫組化結(jié)果由1名副高職稱和1名中級(jí)職稱病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，如果出現(xiàn)判定差異，以副高職稱人員意見為準(zhǔn)，或再請(qǐng)1名副高職稱人員閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。測(cè)量結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的結(jié)果以百分比（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。通過(guò)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)法分析S100A8和S100A9蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性。使用Kaplan-Meier生存分析法分析生存數(shù)據(jù)。差異結(jié)果判定：當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A8和S100A9在鼻咽癌組織及鼻咽炎性組織中的表達(dá)鼻咽癌組織中S100A8和S100A9陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.2%和72.8%，鼻咽炎性組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為17.4%、37.0%，兩組之間S100A8和S100A9表達(dá)陽(yáng)性率相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 鼻咽癌組織及鼻咽炎組織中S100A8和S100A9表達(dá)情況Tab.2 The expression of S100A8 and S100A9 in nasopharyngeal carcinoma and nasopharyngitis例（%）

2.2 S100A8和S100A9表達(dá)情況與臨床病理的關(guān)系S100A8和S100A9表達(dá)與患者的性別和年齡無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），而與分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。見表3。

圖1 S100A8、S100A9在鼻咽癌中的表達(dá)情況Fig.1 The expression of S100A8 and S100A9 in nasopharyngeal carcinoma

2.3 S100A8和S100A9在鼻咽癌組織中表達(dá)相關(guān)性分析鼻咽癌組織標(biāo)本中S100A8的表達(dá)與S100A9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性（r=0.4，P＜0.001）。見表4。

表3 S100A8和S100A9表達(dá)情況與臨床病理的關(guān)系Tab.3 The relationship between expression of S100A8，S100A9 and clinical pathology例（%）

2.4 S100A8和S100A9表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系根據(jù)S100A8、S100A9表達(dá)情況，92例鼻咽癌患者分成4組，S100A8（-）S100A9（-）患者（A組）20例，失訪1例，實(shí)訪19例；S100A8（-）S100A9（+）患者（B組）24例，失訪2例，實(shí)訪22例；S100A8（+）S100A9（-）患者（C組）5例，無(wú)失訪；S100A8（+）S100A9（+）患者（D組）43例，失訪5例，實(shí)訪38例。將各個(gè)組患者的生存期情況分析結(jié)果繪制成Kaplan-Meier生存曲線，經(jīng)log-rank趨勢(shì)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)組之間生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.3，P=0.016）。隨后，采用Bonferroni法進(jìn)行兩組間比較，結(jié)果顯示，A組明顯高于D組（χ2=8.4，P=0.004）；而其他各組之間無(wú)明顯差異（A組vs.B組：χ2=1.9，P=0.2；A組vs.C組：χ2=1.6，P=0.2；B組vs.C組：χ2=0.3，P=0.6；B組vs.D組：χ2=3.3，P=0.069；C組vs.D組：χ2=0.4，P=0.5）。見圖2。

表4 鼻咽癌組織S100A8和S100A9表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.4 Analysis of the correlation between expression of S100A8 and S100A9例（%）

圖2 S100A8和S100A9表達(dá)水平與患者總生存期的關(guān)系Fig.2 Overall survival of patients according to the expression of S100A8and S100A9

3 討論

S100A8和S100A9基因均定位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶（1q21區(qū)帶），1q21-q23區(qū)帶為惡性腫瘤基因轉(zhuǎn)錄的共同激活靶區(qū)域，該區(qū)帶的穩(wěn)定性極易受到外界刺激、內(nèi)環(huán)境改變以及某些細(xì)胞因子水平等因素的影響，易產(chǎn)生缺失、易位等變異情況，研究顯示此區(qū)域染色體的改變與腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系[6]。研究[7]顯示S100A8和S100A9蛋白與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等存在密切的相關(guān)性。

研究[8]顯示胃癌中S100A8和S100A9的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且與胃癌的黏膜浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的侵襲性存在明顯的相關(guān)性。有研究[4]通過(guò)免疫組化、ELISA和 Western-blot等多種方法對(duì)鼻咽癌中S100A8和S100A9蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，顯示其水平均明顯高于正常組織。但是，也有研究結(jié)果顯示S100A8和S100A9蛋白在低分化食管鱗癌細(xì)胞和宮頸鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平是顯著低于正常組織[9]。本研究中，筆者使用免疫組化方法分別檢測(cè)S100A8、S100A9在鼻咽癌組織和鼻咽炎性組織中表達(dá)情況，結(jié)果顯示S100A8和S100A9在鼻咽癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于鼻咽炎性組織（P＜0.05），并且S100A8和S100A9的異常高表達(dá)與鼻咽癌的性別、年齡無(wú)密切的關(guān)系（P＞0.05），而與鼻咽癌的分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，表明隨著鼻咽癌侵襲能力的增強(qiáng)，S100A8和S100A9的表達(dá)水平也明顯增加，推測(cè)S100A8和S100A9在腫瘤的侵襲中發(fā)揮作用。LIM等[10]研究認(rèn)為，轉(zhuǎn)移性肝癌微環(huán)境中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)S100A8和S100A9蛋白、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成等多個(gè)相互獨(dú)立的機(jī)制來(lái)增強(qiáng)肝轉(zhuǎn)移瘤的侵襲能力，而阻斷S100A8或S100A9蛋白的表達(dá)可以減低組織培養(yǎng)中細(xì)胞的遷移和侵襲潛力，以及體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移瘤的形成和其中肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲，可見S100A8和S100A9是腫瘤細(xì)胞具備侵襲性的重要蛋白。

S100A8的表達(dá)與S100A9的表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者在鼻咽癌的形成和發(fā)展過(guò)程中可能具有協(xié)同作用。S100A8和S100A9以鈣依賴的方式形成S100A8/A9異質(zhì)二聚體復(fù)合物[11]，其中S100A8是主要的生物活性蛋白，發(fā)揮其生物學(xué)功能，而S100A9通過(guò)調(diào)節(jié)S100A8來(lái)保證其功能的穩(wěn)定性[12]。NISHIMURA 等[13]認(rèn)為，S100A8、S100A9 蛋白及S100A8/A9二聚體對(duì)細(xì)胞的侵襲及遷移具有明顯的調(diào)控效果。LIU等[14]研究發(fā)現(xiàn)S100A8在肝癌細(xì)胞系中的過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力加強(qiáng)和腫瘤生長(zhǎng)的增快，在肝癌組織中的S100A8甲基化水平低于相鄰正常組織，且低甲基化與總生存期縮短和無(wú)進(jìn)展生存期相關(guān)，S100A8可能在肝癌中作為腫瘤啟動(dòng)子發(fā)揮一定作用。本研究以S100A8和S100A9表達(dá)情況分組作生存曲線發(fā)現(xiàn)，S100A8（+）S100A9（+）患者5年生存率最低，S100A8（-）S100A9（-）患者5年生存率最高。雖然S100A8和S100A9表達(dá)均為陰性者的生存率與其中之一表達(dá)陽(yáng)性者的生存率相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但生存率曲線圖仍然可以觀察到有分開的趨勢(shì)。生存分析結(jié)果表明，S100A8、S100A9表達(dá)陽(yáng)性患者的預(yù)后比S100A8、S100A9表達(dá)陰性患者的預(yù)后差，提示S100A8、S100A9的表達(dá)可作為鼻咽癌預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。

總之，S100A8和S100A9在鼻咽癌組織中的表達(dá)升高，兩種蛋白的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良，與鼻咽癌的嚴(yán)重程度呈相關(guān)性，可作為鼻咽癌臨床治療及預(yù)測(cè)預(yù)后的重要指標(biāo)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。