劉少杰 陳騰騰 陳曉越 薛秀芬 朱影玲

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院1乳腺外科，2病理科（廣東惠州 516001）

乳腺癌的發(fā)生已位居女性惡性腫瘤的首位。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)R-脊椎蛋白（RSPO1）的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[1-2]。有研究[3]表明，Wnt/β-catenin信號通路在乳腺癌組織中存在過度激活，且與癌細(xì)胞的生長、增殖、遷移有關(guān)。關(guān)于RSPO1與Wnt/β-catenin信號的臨床病理相關(guān)性研究未見報道，筆者通過檢測RSPO1、SFRP1和β-catenin在非特殊型乳腺浸潤性癌（breast invasive carcinoma of no specific type，BIC-NST）和乳腺導(dǎo)管原位癌（breast ductal carcinoma in situ，BDCIS）中的表達(dá)，探討其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為BIC-NST的臨床預(yù)測、控制腫瘤進(jìn)展提供新的靶點和治療策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集惠州市中心人民醫(yī)院2009年1月至2015年12月224例BIC-NST、155例BDCIS及癌旁正常組織（normal breast tissues adjacent to carcinoma，NBTAC）379例，參照2012年WHO乳腺腫瘤Bloom-Richardson改良標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行BIC-NST的組織學(xué)分級及pTNM分期；BDCIS分為低級別、中等級別和高級別3級（結(jié)合腫瘤壞死、細(xì)胞極向和細(xì)胞核特征）。取距癌組織＞0.5 cm的正常乳腺組織作對照[1]，將BDCIS的癌旁正常組織155例用NBTAC1表示，BIC-NST的癌旁正常組織224例用NBTAC2表示。所有患者病理資料完整，入院前未進(jìn)行任何化療和放療?；颊咧橥獠⒏嬷獦?biāo)本只用于科學(xué)研究（患者知情同意書由惠州市中心人民醫(yī)院倫理委員會鑒定批準(zhǔn)，并由科教部管理存檔）。

1.2 試劑與方法兔抗RSPO1多克隆抗體（購自英國abcam公司，ab231125）、兔抗SFRP1單克隆抗體（購自英國abcam公司，EPR7003，ab126613）、兔抗β-catenin多克隆抗體（購自美國Santa cruz公司）和羊抗兔二抗（購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），SP及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；每組免疫染色分別設(shè)立陽性和陰性對照，采用免疫組化SP法，按說明書進(jìn)行實驗操作。

1.3 制作組織芯片采用Quick-Ray tissue microarray system，選取目標(biāo)石蠟標(biāo)本的所需區(qū)域，供者蠟塊37～40℃孵育15～20 min，用轉(zhuǎn)移器抽提目標(biāo)蠟塊組織，并緩慢轉(zhuǎn)移至受者蠟塊的相應(yīng)孔內(nèi)（4 mm深度，直徑2 mm×60孔），并做好每孔病例標(biāo)記和記錄，組織芯片置于包埋盒中70℃烤30～60 min，至完全透明后包埋，-20℃硬化后備用。每個病例采用3個復(fù)孔用于評價。

1.4 免疫組化SP法將組織芯片的白片65℃烤60 min，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，3%H2O2孵育15 min，0.1%枸櫞酸緩沖液高壓抗原修復(fù)，滴加兔抗一抗RSPO1、SFRP1和β-catenin（濃度1：100稀釋），4℃冰箱過夜，PBS×3次，滴加山羊抗抗兔二抗（50 μL），常溫孵育40 min，DAB顯色，顯微鏡下觀察并及時終止顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每批染色均用同源抗體做陰性對照。

1.5 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)所有免疫切片由2名病理醫(yī)師雙盲獨立重復(fù)閱片，采用同一評價方法，分別評價BIC-NST和BDCIS的RSPO1、SFRP1、β-catenin表達(dá)，對同時含有BIC-NST和BDCIS的病例分別進(jìn)行評價（約有20%的BIC-NST病例同時伴有BDCIS），對于BDCIS伴微小浸潤的病例按BDCIS來評價，當(dāng)整張切片表達(dá)的著色強度存在異質(zhì)性時，以整張切片表達(dá)最強（＞10%）的部位來評價。判斷標(biāo)準(zhǔn)具體如下：根據(jù)染色面積分別評分：0分：≤ 5%，1分：5%～24%，2分：25%～49%，3分：50%～74%，4分：≥75%；根據(jù)著色強度分別評分：1分：弱陽性，2分：中等陽性，3分：強陽性?？偡?染色面積×著色強度，總分≥5分為高表達(dá)，≤4分為低表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS組織中的表達(dá)比較，以及各臨床病理參數(shù)組間表達(dá)的差異性比較均采用卡方檢驗，組間的相關(guān)性分析采用Spearman分析，所有P值采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS中的表達(dá)RSPO1蛋白定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞漿陽為主，呈棕色顆粒分布（圖1A～C）；SFRP1蛋白定位于細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜陽為主，呈棕色顆粒分布（圖1D～F）；β-catenin蛋白定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，以細(xì)胞核陽為主，呈棕色顆粒分布（圖1G～I(xiàn)）。RSPO1和β-catenin在BICNST及BDCIS組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織（P＜0.01），而SFRP1在BIC-NST及BDCIS組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織（P＜0.01）。RSPO1和β-catenin在高級別BDCIS的表達(dá)率明顯高于低級別組（P＜0.01），在Ⅲ級BIC-NST分化組的表達(dá)率明顯高于Ⅰ級分化組（P＜0.05），而且組織分級越高，RSPO1和β-catenin表達(dá)越高，呈明顯的正相關(guān)（P＜0.05）；但SFRP1在Ⅲ級BIC-NST分化組的表達(dá)率明顯低于Ⅰ級分化組（P＜0.05），而且組織分級越高，SFRP1表達(dá)越低，與RSPO1和β-catenin呈明顯的負(fù)相關(guān)（P＜0.01）；在BDCIS組織中SFRP1表達(dá)與分級不相關(guān)（表1）。

圖1 RSPO1、SFRP1、β-catenin在乳腺各組織中的表達(dá)情況（× 400）Fig.1 Expression of RSPO1，SFRP1 and beta-catenin in breast tissues

表1 NBTAC、BDCIS和BIC-NST組織中RSPO1、SFRP1和β-catenin蛋白表達(dá)的陽性表達(dá)率Tab.1 The positive of expression rate of RSPO1，SFRP1 and β-catenin protein in NBTAC，BDCIS and BIC-NST tissues

2.2 RSPO1、SFRP1和β-catenin在BIC-NST及BDCIS中表達(dá)的相關(guān)性在BIC-NST組織中，RSPO1與β-catenin呈正相關(guān)（r=0.114，P=0.023），SFRP1與β-catenin呈負(fù)相關(guān)（r=-0.132，P＜ 0.001），RSPO1與SFRP1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.217，P=0.011）（表2、3）。

表2 RSPO1、SFRP1與β-catenin蛋白表達(dá)在BDCIS及BIC-NST中的相關(guān)性分析Tab.2 The correlation between the expression of RSPO1，SFRP1 andβ-catenin protein in BDCIS and BIC-NST

表3 RSPO1與SFRP1蛋白表達(dá)在BDCIS及BIC-NST中的相關(guān)性分析Tab.3 The correlation between the expression of RSPO1 and SFRP1 protein in BDCIS and BIC-NST

2.3 BIC-NST組織中RSPO1、SFRP1和β-catenin的表達(dá)與臨床因素的關(guān)系RSPO1和β-catenin表達(dá)在患者臨床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的表達(dá)（P＜0.01），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤相關(guān)（P＜0.01），但與年齡、腫物大小不相關(guān)；SFRP1表達(dá)在患者臨床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)明顯低于Ⅰ+Ⅱ期的表達(dá)（P＜0.01），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤相關(guān)（P＜0.01），但與年齡、腫物大小不相關(guān)（表4）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)R-脊椎蛋白（RSPO）在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。據(jù)報道RSPO1/LGR5與結(jié)腸癌細(xì)胞中的TGFβⅡ型受體協(xié)同直接激活TGFβ信號傳導(dǎo)，增強TGFβ介導(dǎo)的生長抑制和應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移，并在體內(nèi)原位結(jié)腸癌模型中也得到了驗證[4]。在卵巢癌中，RSPO1在癌細(xì)胞和癌組織中表達(dá)上調(diào)，通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)癌細(xì)胞存活，生長和耐藥[5]。此外研究[6]發(fā)現(xiàn)RSPO2-GPR48/LGR4通路的上調(diào)通過促進(jìn)ERK磷酸化促進(jìn)乳頭狀甲狀腺癌的腫瘤侵襲性，為治療分化型甲狀腺癌提供了一個新的治療靶點。

研究報道，乳腺癌中RSPO蛋白與經(jīng)典Wnt通路配體類似，通過激活和與Wnt配體等協(xié)同激活Wnt/β-catenin信號通路來參與調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化[7]。本研究，RSPO1在BIC-NST及BDCIS組織中明顯高表達(dá)，RSPO1在高級別BDCIS和Ⅲ級BICNST中的表達(dá)率明顯高于低級別BDCIS組和Ⅰ級BIC-NST分化組，且組織分級越高，RSPO1表達(dá)越高。有研究也證明，小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）模型中存在RSPO2和RSPO3基因的過度激活，且RSPO蛋白可調(diào)控Wnt/β-catenin 信號通路[8]；Wnt1、RSPO2高表達(dá)可促進(jìn)裸鼠乳腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化及乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、侵襲和轉(zhuǎn)移[10]?？梢?，RSPO可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞癌變，且RSPO和Wnt蛋白在激活Wnt/β-catenin信號通路中起正協(xié)同作用。本研究結(jié)果也提示在BIC-NST組織中，RSPO1與β-catenin正相關(guān)；且RSPO1和β-catenin表達(dá)在患者臨床分期Ⅲ+Ⅳ期中的表達(dá)明顯高于Ⅰ+Ⅱ期的表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤密切相關(guān)。

MATSUDA等[10]研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中上調(diào)SFRP1能阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而減少腫瘤細(xì)胞增殖，并且抑制異體移植小鼠模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。本研究，SFRP1在BIC-NST及BDCIS組織中明顯低表達(dá)，SFRP1在Ⅲ級BIC-NST分化組的表達(dá)率明顯低于Ⅰ級分化組，且組織分級越高，SFRP1表達(dá)越低；SFRP1在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者組織中也明顯低表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管浸潤相關(guān)。KLOPOCKI等[11]研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SFRP1，可顯著降低SFRP1對Wnt信號通路的抑制作用，促使Wnt信號通路異常活化，導(dǎo)致BIC-NST的進(jìn)展。本研究，BIC-NST組織中SFRP1與RSPO1和β-catenin呈明顯的負(fù)相關(guān)，但在BDCIS組織中SFRP1表達(dá)與分級不相關(guān)，進(jìn)一步表明，BICNST與BDCIS具有不同腫瘤發(fā)生學(xué)和遺傳表型。

表4 BIC-NST組織中RSPO1、SFRP1、β-catenin蛋白表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.4 The relation between the expression of RSPO1，SFRP1，β-catenin protein in BIC-NST with clinical pathological features例

綜上所述，高表達(dá)的RSPO1、β-catenin蛋白和低表達(dá)SFRP1蛋白與BIC-NST細(xì)胞的增殖分化、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，RSPO1與β-catenin正相關(guān)，而SFRP1與β-catenin、RSPO1之間存在負(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)作用，RSPO1、SFRP1與β-catenin蛋白是與乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)記物，聯(lián)合檢測是否可以成為乳腺癌患者獨立的預(yù)后及監(jiān)測指標(biāo)仍需要進(jìn)一步探討和研究。