張盧舜 李育莊 李春輝

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科（河北承德 067000）

胃癌是常見的惡性腫瘤[1]，近年來胃癌發(fā)病率呈上升趨勢，胃癌常需靶向治療[2-3]，因此，研究胃癌的發(fā)病機(jī)制及尋找胃癌治療新的藥物作用靶點(diǎn)顯得尤為重要。心房鈉尿肽受體A（natriuretic peptide receptor-A，NPR-A）在肺癌、前列腺癌等中均有表達(dá)[4-6]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路的異常能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖且能增強(qiáng)細(xì)胞遷移及血管生成。細(xì)胞骨架微管蛋白a（Tubulin-a）作為細(xì)胞骨架的重要組成部分與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。有關(guān)胃癌中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a的表達(dá)及臨床意義的研究目前尚未見報(bào)道，本研究用免疫組化、Western blotting及QRT-PCR檢測胃癌中NPRA、P38MAPK、Tubulin-a的蛋白和mRNA表達(dá)，并分析其與臨床病理特征間的關(guān)系及相關(guān)性，為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制提供新的思路，為胃癌的靶向治療提供潛在的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2016年9月至2017年9月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)治療的胃癌患者標(biāo)本41例，術(shù)中均留取胃癌組織和正常胃黏膜組織（距腫瘤邊緣10 cm以上），所有患者術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后均由病理確診為胃腺癌，其中男27例，女14例，年齡38～85歲，高中分化17例、低分化24例，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期22例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，漿膜浸潤34例、無漿膜浸潤7例（本研究經(jīng)倫理委員會通過）。

1.2 蛋白檢測

1.2.1 免疫組化方法采用SP法測定NPR-A、P38MAPK和Tubulin-a在標(biāo)本中的表達(dá)，具體步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。以PBS代替一抗做陰性對照。采用雙盲法判定，兩名實(shí)驗(yàn)人員單獨(dú)閱片，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞所占百分比評分的乘積來判定蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 Westernblotting法 取約0.1 g新鮮組織，按試劑盒說明得到蛋白上清液，以BCA法測定蛋白濃度，進(jìn)行10%sSDS-Page凝膠電泳，加入一抗、二抗后，用ECL發(fā)光法顯影，得到圖像運(yùn)用Image J分析得到灰度值，以目的蛋白灰度值除以內(nèi)參灰度值得到目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3 基因檢測運(yùn)用QRT-PCR法檢測。按照試劑盒說明，進(jìn)行RNA提取并測其濃度，然后依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行QRT-PCR擴(kuò)增。各指標(biāo)引物序列均經(jīng)TAKARA公司設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以2-ΔΔCt來表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和連續(xù)性校正的χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用兩組間t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白和mRNA在胃癌組織和正常胃黏膜組織表達(dá)比較免疫組化顯示NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a陽性表達(dá)為彌漫分布于胞質(zhì)和胞膜的棕黃色顆粒，染色顆粒粗大。胃癌組織組化切片中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a陽性表達(dá)率分別為26.8%（11/41）、46.3%（19/41）、85.4%（35/41），正常胃黏膜組織陽性表達(dá)率分別為56.1%（23/41）、24.4%（10/41）、65.9%（27/41）（P＜ 0.01，P=0.03，P=0.04）；蛋白印記法中胃癌組織蛋白相對表達(dá)量分別為（1.20±0.43）、（2.20±0.43）、（2.07±0.55），正常胃黏膜組織中為（1.90±0.68）、（1.35 ± 0.50）、（1.49 ± 0.48）（均P＜ 0.01）。胃癌組織中NPR-A蛋白相對表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，胃癌組織中P38MAPK、Tubulin-a蛋白表達(dá)量高于正常胃黏膜組織（均P＜0.05，圖1～4）。

胃癌組織中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a mRNA相對于正常胃黏膜組織的表達(dá)量分別為（0.14±0.05）、（3.23 ± 1.25）、（2.07 ± 0.55），胃癌組織中NPR-A的mRNA相對表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，胃癌組織中P38MAPK、Tubulin-a的mRNA相對表達(dá)量表達(dá)量高于正常胃黏膜組織（均P＜0.05，圖5）。

圖1 NPR-A在胃癌和正常黏膜組織中的表達(dá)Fig.1 The expression of NPR-A in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

圖2 P38MAPK在胃癌和正常黏膜組織中的表達(dá)Fig.2 The expression of P38MAPK in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

圖3 Tubulin-a在胃癌和正常黏膜組織中的表達(dá)Fig.3 The expression of cytoskeleton Tubulin-a in gastric carcinoma and normal gastricmucosa

圖4 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a在胃癌組織和正常黏膜組織中的表達(dá)Fig.4 The expression of NPR-A、P38MAPK and Cytoskeleton Tubulin-a protein in gastric carcinoma and normal gastric tissue

2.2 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a的蛋白和mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系NPR-A蛋白的表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。P38MAPK蛋白的表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。Tubulin-a蛋白的表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05。表1）。NPR-A mRNA的表達(dá)與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。P38MAPK mRNA的表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。Tubulin-a mRNA的表達(dá)與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05，表2）。

圖5 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a在胃癌組織和正常黏膜組織中mRNA的表達(dá)Fig.5 The expression of NPR-A、P38MAPK and Cytoskeleton Tubulin-a mRNA in gastric carcinoma and normal gastric tissue

2.3 胃癌組織中NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白和mRNA表達(dá)的相關(guān)性NPR-A與P38MAPK、Tubulin-a蛋白在胃癌組織中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.441，P＜ 0.01；r=-0.354，P＜ 0.01）。NPR-A與P38MAPK、Tubulin-a mRNA在胃癌組織中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.581，P＜ 0.01；r=-0.579，P＜ 0.01）。

3 討論

NPR-A為心房鈉尿肽（ANP）的主要受體，其通過與ANP結(jié)合，從而影響細(xì)胞增殖、凋亡[7]。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中NPR-A蛋白表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，且隨著分化程度降低、浸潤程度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期變高而下降，NPR-A mRNA表達(dá)情況與蛋白一致，說明隨著胃癌的發(fā)生、發(fā)展NPR-A表達(dá)下調(diào)，NPR-A可能起著抑制胃

癌發(fā)生發(fā)展的作用，這就為NPR-A可能成為靶向治療的潛在靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NPR-A在不同類型的癌中NPR-A的表達(dá)不同[8]，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

表1 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expressions of NPRA，P38MAPK and Tubulin-a protein and the clinical pathological features in gastric carcinoma by WB ±s

表1 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expressions of NPRA，P38MAPK and Tubulin-a protein and the clinical pathological features in gastric carcinoma by WB ±s

臨床病理參數(shù)年齡≤60歲＞60歲性別例數(shù)NPR-A P值P38MAPK P值Tubulin-a P值17 14 1.23±0.44 1.15±0.430.612.25±0.37 2.13±0.500.452.20±0.09 1.90±0.190.14男 女分化程度高、中分化低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無 有22 9 13 18 10 21 1.27±0.48 1.03±0.22 1.47±0.48 0.99±0.24 1.52±0.55 1.03±0.24 0.18＜0.01＜0.01 2.25±0.49 2.07±0.19 2.30±0.49 2.18±0.32 2.65±0.29 2.03±0.27 0.30 0.43＜0.01 2.03±0.59 2.18±0.44 1.84±0.64 2.23±0.43 1.67±0.61 2.26±0.41 0.50 0.07＜0.01 TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期浸潤深度＜漿膜層≥漿膜層12 19 1.48±0.51 1.00±0.24＜0.012.56±0.35 2.02±0.28＜0.011.80±0.63 2.24±0.430.03 4 27 2.04±0.26 1.06±0.28＜0.012.66±0.66 2.17±0.370.021.45±0.47 2.16±0.510.01

表2 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between the expressions of NPRA、P38MAPK and Tubulin-a mRNA and the clinical pathological features in gastric carcinoma ±s

表2 NPR-A、P38MAPK、Tubulin-a mRNA表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab.2 The relationship between the expressions of NPRA、P38MAPK and Tubulin-a mRNA and the clinical pathological features in gastric carcinoma ±s

臨床病理參數(shù)年齡≤60歲＞60歲性別例數(shù)NPR-A P值P38MAPK P值Tubulin-a P值15 16 0.15±0.05 0.14±0.050.572.78±1.28 3.64±1.150.061.67±0.64 2.07±0.500.07男 女分化程度高、中分化低分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無 有21 10 13 18 13 18 0.15±0.05 0.13±0.06 0.18±0.05 0.12±0.04 0.18±0.05 0.12±0.04 0.43 0.01＜0.01 3.31±1.19 3.09±1.42 2.73±0.96 3.59±1.35 2.15±0.94 3.75±1.22 0.65 0.06＜0.01 1.83±0.56 1.97±0.69 1.71±0.47 1.99±0.66 1.52±0.42 2.14±0.58 0.55 0.20＜0.01 TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期浸潤深度＜漿膜層≥漿膜層15 16 0.17±0.05 0.12±0.04＜0.012.33±0.99 4.07±0.84＜0.011.46±0.41 2.26±0.47＜0.01 8 23 0.19±0.05 0.12±0.04＜0.012.05±0.88 3.64±1.11＜0.011.48±0.37 2.01±0.610.03

近年來研究顯示，P38MAPK在乳腺癌、前列腺癌等呈過度表達(dá)，表明其可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[9]，本研究結(jié)果顯示胃癌組織中P38MAPK蛋白和mRNA表達(dá)量高于正常胃黏膜組織，說明P38MAPK可能促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但其蛋白隨著浸潤程度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期變高而下降，而mRNA卻上升，推測P38MAPK mRNA隨著胃癌惡性程度加深而增加，磷酸化的P38MAPK才是其活性形式，細(xì)胞外信號磷酸化激活P38MAPK通路后從而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。

已有研究[10]表明Tubulin-a在肺癌等中呈過度表達(dá)；王天陽等[11]運(yùn)用洛鉑通過破壞膽管癌RBE細(xì)胞Tubulin骨架、抑制Tubulin-amRNA的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，導(dǎo)致生長抑制；LV等[12]用牛奶樹堿抑制微管蛋白Tubulin-a聚合從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的自噬。本實(shí)驗(yàn)顯示胃癌組織中Tubulin-a蛋白表達(dá)量高于正常胃組織，說明Tubulin-a很可能促進(jìn)了腫瘤的增殖。本實(shí)驗(yàn)還得出Tubulin-a蛋白和mRNA隨著浸潤程度加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期變高而增加，提示微管蛋白Tubulin-a與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，結(jié)合文獻(xiàn)[13-14]推測Tubulin-a異常表達(dá)與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

有研究[15]顯示有效增加ANP的量來抑制RASMEK1/2-ERK1/2信號通路治療多發(fā)性骨髓瘤，說明ANP和NPR-A結(jié)合可能通過阻礙細(xì)胞周期和抑制RAS-MEK1/2-ERK1/2信號通路影響相關(guān)蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗腫瘤作用，Tubulin-a參與細(xì)胞周期活動是細(xì)胞周期中不可或缺的參與者，而P38MAPK和ERK通路共同參與調(diào)節(jié)了腫瘤細(xì)胞的增殖等[15]，本研究結(jié)果顯示NPR-A與P38MAPK、Tubulin-a蛋白及mRNA在胃癌組織中的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，由此得出NPR-A與P38MAPK、Tubulin-a對胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到拮抗作用，其作用機(jī)制可能是NPR-A可通過調(diào)控信號傳導(dǎo)通路P38MAPK影響細(xì)胞骨架Tubulin-a的改變進(jìn)而抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，本研究前期也發(fā)現(xiàn)胃黏膜組織NPR-A高表達(dá)時，與高濃度ANP結(jié)合顯著下降KCNQ1蛋白的表達(dá)，延遲整流鉀離子通道亞基Kv1.3等的表達(dá)水平降低，抑制P38MAPK和Tubulin-a的表達(dá)，從而抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展，侵襲和侵襲。

總之，筆者對NPR-A與P38MAPK、Tubulin-a蛋白及mRNA在胃癌組織中的關(guān)系研究為胃癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路，為NPR-A成為胃癌治療潛在的藥物作用靶點(diǎn)提供了依據(jù)。