衛(wèi)利民 谷變利 原翔

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院（開元院區(qū)）1甲狀腺乳腺腫瘤外科，2腫瘤表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（河南洛陽 471003）

結(jié)腸癌是造成腫瘤死亡的主要原因之一，近年來在中國的發(fā)病率逐年上升[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展受飲食、環(huán)境和微生物暴露以及宿主免疫等的影響[2]。研究[3-4]表明具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是結(jié)腸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。作為消化道菌群中的橋梁微生物，F(xiàn)n感染造成結(jié)腸病變加劇直至結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制可能是對腸道上皮細(xì)胞有促炎癥作用，并誘導(dǎo)或招募免疫抑制淋巴細(xì)胞，從而造成腫瘤細(xì)胞以及病原菌本身逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[5-6]。

轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是腫瘤微環(huán)境重要的炎癥因子。腫瘤來源的TGF-β1與腫瘤免疫逃逸相關(guān)[7]。TGF-β1的表達(dá)受病原微生物感染影響而上調(diào)，過量表達(dá)的TGF-β1能誘導(dǎo)FoxP3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）[8-10]。CD4+CD25+Treg的功能維持依賴 FoxP3的表達(dá)。FoxP3蛋白水平在抗原刺激后上調(diào)，且上調(diào)幅度與其抑制功能呈正相關(guān)。研究表明幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）可誘導(dǎo)胃上皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，促使初始CD4+T 細(xì)胞分化為Tregs，這些Tregs細(xì)胞抑制激活的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞增殖[11-12]。這種免疫抑制作用與Fn潛在的免疫抑制作用可能相似。研究[13]顯示，感染Fn的腫瘤組織中Fn的載量與T淋巴細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。因此，筆者假設(shè)，F(xiàn)n通過上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)，促進(jìn)Tregs分化，抑制T細(xì)胞的活性。本研究擬通過Fn感染引起結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)變化和對腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的影響，對Fn感染引起結(jié)腸癌免疫抑制機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 病例選擇和樣本采集選擇2016年7月1日至9月30日在河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院開元院區(qū)胃腸外科行手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前未接受放化療者以及無其他部位腫瘤發(fā)生，病理檢查確定為結(jié)腸腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者均排除。最終納入結(jié)腸腺癌病例36例，病例信息為：男22例，女14例；年齡37～75歲（中位年齡61歲）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性17例，陽性19例；臨床TNM分期Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ期20例；左半結(jié)腸15例，右半結(jié)腸9例，乙狀結(jié)腸12例。新鮮結(jié)腸癌組織取自癌灶中心，癌旁組織取自距離癌組織近端邊緣10 cm以上的正常腸粘膜組織。手術(shù)標(biāo)本在離體后15 min內(nèi)收集，凍存于液氮運(yùn)送，-80℃低溫保存至核酸抽提。

1.2 熒光定量PCR結(jié)腸癌組織和癌旁組織、結(jié)腸癌細(xì)胞系和T淋巴細(xì)胞總RNA采用Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）提取，-80℃保存。RNA濃度和完整性經(jīng)紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照HiScript II 1st Strand cDNA Sythesis Kit（南京，諾唯贊公司）說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20℃保存。以cDNA為模板，特異引物（由蘇州金唯智合成）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，β-actin為內(nèi)參。β-actin：上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′；Fn：上游：5′-CTTAGGAATGAGACAGAGATG，下 游 ：5′-TGATGGTAACATACGAAAGG；TGF-β1：上游：5′-CGACTCGCCAGAGTGGTTAT，下游：5′-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAA；FoxP3：上游：5′-ATGCCTCCTCTTCTTCCTTGAA，下游：5′-GGGCATCCACCGTTGAGA。cDNA擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件，按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（南京，諾唯贊）說明書中進(jìn)行，熔解曲線評估是否存在非特異擴(kuò)增。反應(yīng)在BioRad CFX96儀器上進(jìn)行，每組設(shè)置3復(fù)孔，采用2-ΔΔCt法計(jì)算 Fn及各個(gè)基因的相對表達(dá)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定按照SP染色步驟（SP-9000及DAB染色試劑購自福建邁新）進(jìn)行癌組織 TGF-β1（ab92486，Abcam 公司）和FoxP3（ab20034，Abcam公司）免疫組化染色，PBS替代一抗作陰性對照，以商品化的陽性片為陽性對照。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度計(jì)算評分：陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：≤5%計(jì)分0、6%～25%計(jì)分1、26%～50%計(jì)分2、51%～75%計(jì)分3、≥75%計(jì)分4；著色強(qiáng)度：無著色計(jì)分0，淺黃色計(jì)分1，棕黃色計(jì)分2，褐色計(jì)分3；兩項(xiàng)指標(biāo)積分相加為陽性等級：0分為（-）、1～2分為（+）、3～4分為（++）、5～7分為（+++），“++”及以上判斷為陽性。

1.4 細(xì)胞和細(xì)菌培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480、HT29、HCT116和具核梭桿菌ATCC 25586標(biāo)準(zhǔn)菌株由路易斯維爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院王會智教授惠贈。SW480、HT29、HCT116細(xì)胞分別用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM或PRMI 1640完全培養(yǎng)基（Gibco公司），放置5%CO2、飽和濕度、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。Fn標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25586接種于新鮮配制的腦心浸液培養(yǎng)基（梅里埃公司）（含5%無菌脫纖維綿羊血，1%氯化血紅素和0.1%維生素K1），37℃厭氧（5%CO2、10%H2、85%N2）條件下培養(yǎng)。液體增菌后，細(xì)菌重懸計(jì)數(shù)，以100∶1比例（Fn：細(xì)胞株）加入培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的細(xì)菌，37℃、5%CO2孵育24 h。共培養(yǎng)方法及分組：處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶（Solarbio公司）消化后計(jì)數(shù)，加至48孔板中與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為：對照組（加入PBS）、Fn感染組和Fn感染中和組（加入人源TGF-β1中和抗體，R&D公司）。

1.5 ELISA檢測TGF-β1將共培養(yǎng)的培養(yǎng)液吸出至EP管內(nèi)，常溫下10 000 r/min離心5 min，取上清，ELISA法測定TGF-β1含量。實(shí)驗(yàn)過程按照Human TGF-β1 ELISA檢測試劑盒（EH010-48，Ex-Cell Bio公司）說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀（PerkinElmer EnSpire多功能酶標(biāo)儀）在450 nm波長測定光密度（OD值），根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TGF-β1含量（ng/mL），換算成pg/mL作圖。

1.6 初始CD4+T細(xì)胞分離及與HCT116共培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞分離液購自GE公司，T細(xì)胞活化磁珠、CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒、Treg檢測試劑盒購自德國美天旎生物技術(shù)公司。采集Fn感染陰性的健康志愿者全血20mL，外周血淋巴細(xì)胞分離制備，陰性磁珠分選法分離初始CD4+T細(xì)胞。Fn感染HCT116的上清經(jīng)過濾，去除殘留細(xì)菌，制成Fn-條件培養(yǎng)基（Fn-CM）；HCT116細(xì)胞在與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)前，用PBS洗兩次，去除表面結(jié)合的細(xì)菌。TGF-β1中和抗體在加入CD4+T細(xì)胞前先加進(jìn)Fn-CM體系中（取5 μL抗體至5 mL Fn-CM中，使抗體工作濃度為1 μg/mL），作用30 min。共培養(yǎng)體系中，每孔初始CD4+T細(xì)胞：HCT116比例為10∶1，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)5 d做增殖檢測，培養(yǎng)7 d做Treg檢測。

1.7 羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）檢測細(xì)胞增殖新鮮分離的CD4+T細(xì)胞按照CFSE Division Assay Kit（Abnova公司）說明書進(jìn)行操作，采用抗CD3和抗CD28抗體雙激活方法活化CD4+T細(xì)胞。具體：細(xì)胞激活培養(yǎng)使用24孔培養(yǎng)板（用2 μg/mL CD3單克隆抗體包被），每孔加入1×106個(gè)細(xì)胞和溶解的2 μg/mL CD28單克隆刺激性抗體，同時(shí)加入2 ng/mL的人重組IL-2維持細(xì)胞生長。激活3 d的T細(xì)胞加入至HCT116培養(yǎng)體系中5 d，收集CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析增殖。未活化的細(xì)胞用作對照。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)（1）CD4+T細(xì)胞純度測定。新鮮分離的初始CD4+T細(xì)胞，經(jīng)抗人CD4-FITC抗體（eBioscience公司）標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測純度；（2）Treg實(shí)驗(yàn)。CD4+T細(xì)胞與HCT116體系共培養(yǎng)7 d。7 d后，收獲細(xì)胞，洗滌，加入抗人CD25-FITC抗體（eBioscience公司）4℃下孵育1 h。再洗滌，根據(jù)FoxP3固定和透膜試劑盒（eBioscience公司）操作說明加入透膜試劑，然后加入鼠抗人FoxP3-PE偶聯(lián)的抗體，4℃孵育1 h。在Moflo XDP（Beckman）流式細(xì)胞分選儀上檢測，Summit 5軟件分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用（±s）表示。各組間比較采用單因素方差分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，表達(dá)率的比較及相關(guān)性分析采用Fisher確切概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 具核梭桿菌在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)豐度qPCR結(jié)果顯示，69.44%（25/36）結(jié)腸癌組織和63.89%（23/36）癌旁組織中檢測到Fn表達(dá)。在Fn表達(dá)陽性病例，F(xiàn)n表達(dá)豐度在癌組織中較高，與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.079，P=0.004）（圖1）。

圖1 Fn在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達(dá)豐度Fig.1 The mRNA expression abundance of Fusobacterium nucleatum in colon cancer and matched adjacent tissues

2.2 結(jié)腸癌組織TGF-β1表達(dá)和FoxP3+Treg細(xì)胞數(shù)量及其相關(guān)性IHC結(jié)果顯示，TGF-β1表達(dá)于癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞胞漿，F(xiàn)oxP3定位于淋巴細(xì)胞胞核（圖2）。TGF-β1在Fn感染組織中的陽性表達(dá)率為80.00%（20/25），高于無感染組45.45%（5/11），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。Fn感染結(jié)腸癌組織中FoxP3+Treg細(xì)胞的陽性表達(dá)率60%（15/25），高于無感染組27.27%（3/11），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。而Fn感染陽性組，結(jié)腸癌組織中FoxP3表達(dá)與TGF-β1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（χ2=9.375，P=0.005，表3）。

圖2 結(jié)腸癌組織中TGF-β1的表達(dá)和FoxP3+Treg細(xì)胞分布Fig.2 Expression of TGF-β1 and distribution of FoxP3+Treg cells in colon cancer tissues

表1 結(jié)腸癌組織中TGF-β1表達(dá)與Fn感染的相關(guān)性Tab.1 The correlation between TGF-β1 expression and Fusobacterium nucleatum infection in colon cancer tissues例

表2 結(jié)腸癌組織中FoxP3表達(dá)與Fn感染的相關(guān)性Tab.2 The correlation between FoxP3 expression and Fusobacterium nucleatum infection in colon cancer tissues例

表3 Fn感染陽性結(jié)腸癌組織中FoxP3與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性Tab.3 The correlation between FoxP3 and TGF-β1 expression in Fusobacterium nucleatum-positive colon cancer tissue例

2.3 Fn感染對結(jié)腸癌細(xì)胞株TGF-β1表達(dá)的影響Fn以100：1比例（Fn：細(xì)胞）感染SW480、HT29、HCT116細(xì)胞。ELISA檢測感染的3個(gè)細(xì)胞系TGF-β1增加分別是對照組的2.905、3.411、6.304倍；qPCR檢測感染16 h結(jié)果顯示，TGF-β1 mRNA相對表達(dá)量增加，分別是對照組的1.546±0.080（t=10.531，P=0.009）、1.325 ± 0.064（t=7.163，P=0.019）、1.817 ± 0.234（t=11.720，P=0.007）倍（圖3）。由于HCT116變化較為顯著，本研究選擇HCT116細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖3 Fn感染對腫瘤細(xì)胞TGF-β1表達(dá)的上調(diào)作用Fig.3 Effect of Fusobacterium nucleatum infection on expression of TGF-β1 in tumor cells

2.4 Fn感染的HCT116細(xì)胞對CD4+T細(xì)胞增殖的影響CD4+T細(xì)胞增殖經(jīng)CFSE標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測，休眠CD4+T細(xì)胞的熒光強(qiáng)度與未增殖細(xì)胞相同（圖4A），活化的CD4+T細(xì)胞與未感染的HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)增殖傳代（圖4B），以及活化的CD4+T細(xì)胞與Fn感染的HCT116細(xì)胞共培養(yǎng)后（圖4C），結(jié)果顯示CD4+T細(xì)胞增殖百分比與對照組相比減少將近28%[（59.69±1.28）%vs.（87.11±1.50）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.540，P=0.002）；加入抗TGF-β1的中和抗體后（圖4D），CD4+T細(xì)胞增殖比例與感染組相比有所升高[（72.71± 1.12）%vs.（59.69± 1.28）%]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.840，P=0.008）。

圖4 Fn感染HCT116細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖Fig.4 The TGF-β1 produced by HCT116 cells in the conditions of Fusobacterium nucleatum infection inhibits the proliferation of activated CD4+T cells

2.5 Fn感染的HCT116細(xì)胞對CD4+CD25+FoxP3+Treg的影響流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)n感染的共培養(yǎng)組，CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例增加，達(dá)到（7.41±0.01）%，與對照組 Treg的（2.12±0.01）%相比，上調(diào)將近4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.387，P=0.033）。Fn感染的共培養(yǎng)組加入TGF-β1中和抗體后，Treg細(xì)胞數(shù)量下降將近50%（4.16±0.01）%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.504，P=0.073，圖5）。qPCR檢測T細(xì)胞FoxP3 mRNA相對表達(dá)結(jié)果為對照組（1.100±0.009）、感染共培養(yǎng)組（3.853±0.074）、加入中和抗體組（2.322±0.049），感染共培養(yǎng)組與對照組相比FoxP3 mRNA表達(dá)上調(diào)（t=37.190，P＜0.001），加入中和抗體組，F(xiàn)oxP3 mRNA表達(dá)與感染共培養(yǎng)組相比有所下降（t=17.380，P＜ 0.001，圖5）。

圖5 Fn感染結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β1促進(jìn)休眠期初始CD4+T細(xì)胞發(fā)育為FoxP3+Tregs細(xì)胞Fig.5 The TGF-β1 produced by colon cancer cells in the conditions of Fusobacterium nucleatum infection promotes the development of the initial CD4+T cells in the dormant period into FoxP3+Tregs cells

3 討論

近年來，F(xiàn)n感染與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展以及機(jī)體抗腫瘤免疫之間關(guān)系的研究越來越多地受到關(guān)注[2-3]。本研究采用qPCR方法驗(yàn)證了Fn在大多數(shù)結(jié)腸癌組織中的過量表達(dá)。在Fn感染陽性的組織中，TGF-β1表達(dá)與CD4+FoxP3+Treg細(xì)胞分布呈正相關(guān)。ELISA和qPCR檢測結(jié)果表明Fn感染引起SW480、HT29和HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1表達(dá)上調(diào)。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，上調(diào)的TGF-β1顯著抑制CD4+T細(xì)胞增殖。另外，qPCR檢測到TGF-β1上調(diào)促進(jìn)FoxP3 mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞檢測到CD4+CD25+FoxP3+Treg亞群數(shù)量增加。結(jié)果提示，F(xiàn)n感染后能夠在腸道內(nèi)長期定植，與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其機(jī)制可能與上調(diào)的TGF-β1對腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的抑制作用有關(guān)。

研究表明，TGF-β可通過影響免疫細(xì)胞發(fā)育、分化、誘導(dǎo)耐受及免疫穩(wěn)態(tài)等引起廣泛的免疫抑制；此外，TGF-β通過抑制腫瘤患者的免疫監(jiān)視在癌癥中發(fā)揮重要的作用[8，14]。在哺乳動物TGF-β的3個(gè)高度同源的家族成員中，最主要的是TGF-β1，它具有免疫調(diào)節(jié)的重要特性[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)n感染會引起人牙齦成纖維細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌TGF-β增加[17]；目前發(fā)現(xiàn)Hp感染胃癌細(xì)胞引起TGF-β1上調(diào)的研究較多[8，18]，但Fn感染引起腫瘤細(xì)胞TGF-β1變化的研究極少。最近，一項(xiàng)研究[19]顯示，在基于qPCR檢測確定的Fn高表達(dá)豐度的結(jié)腸癌組織中，靶向下一代測序結(jié)果顯示TGF-β信號通路明顯比低表達(dá)豐度組織上調(diào)。因此，本研究首次在臨床和細(xì)胞分子水平研究了Fn感染與結(jié)腸癌TGF-β1的相關(guān)性，及Fn感染對結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1分泌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fn感染的人結(jié)腸癌組織中TGF-β1高表達(dá)，而Fn感染24 h后，結(jié)腸癌細(xì)胞上清中TGF-β1及細(xì)胞TGF-β1 mRNA均有不同程度升高，這與LEE等[19]報(bào)道的Fn感染高表達(dá)TGF-β信號通路活化結(jié)果相符合。

TGF-β1是維系CD4+CD25+Treg功能的重要因子。本研究通過流式細(xì)胞分析和qPCR技術(shù)檢測到活化的CD4+T細(xì)胞增殖抑制、FoxP3 mRNA水平上調(diào)以及CD4+CD25+FoxP3+Treg亞群增加。本研究結(jié)果顯示Fn感染的共培養(yǎng)體系強(qiáng)烈抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖，而在加入TGF-β1的中和抗體后這種抑制作用被部分解除，表明Fn感染上調(diào)的TGF-β1抑制活化的CD4+T細(xì)胞的增殖。已有研究表明，TGF-β1能引起抗原刺激的（初始效應(yīng)）CD4+CD25-T細(xì)胞FoxP3的表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)FoxP3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制CD4+T細(xì)胞增殖[20]，與本研究結(jié)果一致。腸道中的Fn可直接或間接地作用于淋巴細(xì)胞，通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡或產(chǎn)生促炎癥微環(huán)境，以及招募腫瘤浸潤免疫細(xì)胞等機(jī)制，抑制局部免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生腫瘤免疫逃逸[5]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Fn感染的人結(jié)腸癌組織中TGF-β1高表達(dá)和FoxP3+Treg分布密集，且二者相關(guān)；Fn感染引起人結(jié)腸癌細(xì)胞TGF-β1上調(diào)表達(dá)，可明顯抑制活化的CD4+T細(xì)胞增殖，促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)以及CD4+CD25+FoxP3+Treg亞群的增多。因此，F(xiàn)n感染可能經(jīng)由上調(diào)TGF-β1影響腫瘤免疫微環(huán)境，產(chǎn)生局部免疫抑制效應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，但Fn感染與TGF-β1表達(dá)之間的具體分子機(jī)制需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究。