張淑紅 張金波 劉東海 金紹靜 王淑秋 朱金玲

佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（黑龍江佳木斯154007）

癲癇是一種常見的反復(fù)發(fā)作的慢性腦部疾病[1]，目前臨床癲癇治療主要包括抗癲癇藥物治療以及手術(shù)治療。常用藥物副作用比較小的主要是卡馬西平和奧卡西平，但長期使用會導(dǎo)致抗藥性，因此開發(fā)新的抗癲癇藥物以獲得更好的療效一直倍受關(guān)注。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）是一種植物內(nèi)富含的酚類化學(xué)物質(zhì)[2]，F(xiàn)A具有多效生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗凋亡等特性[3]。FA對腦損傷、脊髓缺血和阿爾茨海默病樣病理具有神經(jīng)保護作用[4-5]。FA還能增加細胞色素c的穩(wěn)定性，從而抑制細胞凋亡[6]。目前阿魏酸鈉已在臨床應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的副作用，另有研究[7]證明，F(xiàn)A可以減少過氧自由基誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細胞死亡，減少蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的羥基自由基。2017年REN等[8]通過細胞水平和動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)FA可通過抗氧化和抗凋亡機制對腦缺血/再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用。目前關(guān)于FA的抗癲癇研究少見，一項研究[9]結(jié)果顯示FA具有抗癲癇作用，可預(yù)防由戊四氮點燃引起的氧化應(yīng)激和認知障礙。癲癇持續(xù)發(fā)作可導(dǎo)致患者腦神經(jīng)元細胞凋亡，Bcl-2和Bax是凋亡途徑的關(guān)鍵因子，為此本研究選擇FA作為治療癲癇的藥物，探討其在PTZ誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作模型中的神經(jīng)保護作用，以及FA是否通過抗凋亡途徑起作用，為FA在臨床的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組2017年9月15日從哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部購置清潔級雄性Wistar大鼠[體質(zhì)量（200±20）g，黑龍江省佳木斯大學(xué)實驗動物中心（動物使用許可證編號為SYXK（黑）2016-014）]，房間溫度為（22±2）℃，自由獲取食物和水。將60只大鼠隨機分成5組（n=12）：生理鹽水組，大鼠僅注射生理鹽水；戊四氮組（PTZ組），大鼠僅注射PTZ（35 mg/kg，腹腔注射）；低劑量FA組（25 mg/kg，腹腔注射）；中劑量FA組（50 mg/kg，腹腔注射）；高劑量FA組（100 mg/kg，腹腔注射）。低劑量FA組、中劑量FA組、高劑量FA組在注射PTZ前30 min分別注射不同濃度的FA。各組均在每日中午12時給藥，連續(xù)28 d。藥物濃度根據(jù)文獻[10-11]選擇。連續(xù)3 d Racine評分在4或5分以上的大鼠視為癲癇大鼠模型建造成功。本研究得到佳木斯大學(xué)倫理道德委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)編號：JMSU-222）。

1.2 主要試劑FA購于上海源葉生物科技有限公司；PTZ由Sigma提供；Bcl-2和Bax等抗體購自武漢博士生物工程有限公司；245廣譜蛋白Marker，10×轉(zhuǎn)膜液，20×TBS購于北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DAB試劑盒購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；其他試劑均由分子實驗室提供。

1.3 PTZ誘導(dǎo)的癲癇大鼠行為評估將PTZ溶解在鹽水中，除生理鹽水組外的大鼠均進行PTZ處理后將大鼠置于透明的籠中，觀察其驚厥行為30 min。癲癇發(fā)作的潛伏期（s），癲癇持續(xù)時間（s）和癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度（根據(jù)Racine評分[12]）。如果在30 min內(nèi)沒有觀察到癲癇發(fā)作的跡象，則最大潛伏期為1 800 s。

1.4 取材在4周結(jié)束時麻醉大鼠，然后使用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進行心臟灌注以洗掉血液?？焖贁囝^取出腦并置于冰盤上，分離兩個半球。從一個半球切出海馬區(qū)域并立即在液氮中冷凍以供進一步使用。將另一半球在4%多聚甲醛溶液中固定72 h，然后石蠟包埋，制備海馬體的連續(xù)冠狀切片（4 μm）。

1.5 Hochest33258染色法檢測細胞凋亡 石蠟切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟后用枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）97℃水浴10 min。PBS洗2遍，每次3 min。加入Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染液，用PBS洗2遍，每次3 min。滴一滴抗淬滅封片液，蓋上一潔凈的蓋玻片，盡量避免氣泡。使用Olympus熒光顯微鏡觀察，最后用Image pro plus6.0來測量海馬神經(jīng)元的凋亡率。

1.6 WesternBlot法分析Bcl-2和Bax在海馬組織中的表達 取出液氮中的海馬組織，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冷勻漿緩沖液中勻漿，12 000 r/min離心10 min。除去上清液，稀釋至等量的蛋白質(zhì)（50 μg）并在95℃煮沸4 min。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離變性蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上。用含3%脫脂乳的TBST液，在37℃下封閉膜90 min，再4℃下與針對Bax和Bcl-2的特異性兔多克隆抗體一起孵育過夜。通過在TBST或PBST中洗滌膜3次，每次5 min，除去過量的一抗。將1∶1 000稀釋的二抗（抗兔IgG）與膜在室溫下溫育1 h。將膜在室溫下暴露于透明度增強的化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）2 min，并使用ChemiDocMP顯現(xiàn)。Tanon GLS軟件進行條帶強度的檢測和定量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用方差同質(zhì)性檢驗方差是否齊性，當(dāng)方差齊性時，使用單因素方差檢驗；當(dāng)方差不齊時，使用Welch方法進行比較，并將LSD用于多重比較。以P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FA對癲癇發(fā)生的影響在評估時間點，與PTZ組相比，F(xiàn)A組的Racine評分顯著降低，癲癇發(fā)作持續(xù)時間顯著減少（F=76.51，P＜0.01），而癲癇發(fā)作潛伏期顯著增加（F=67.86，P＜0.01），且隨著藥物濃度的增加顯著性增強，見圖1。結(jié)果表明，F(xiàn)A可以減少或預(yù)防自發(fā)性癲癇的發(fā)生，延長生存期。

2.2 Hochest33258染色法檢測細胞凋亡 與PTZ組相比，生理鹽水組大鼠的海馬CA1區(qū)域沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)元凋亡，統(tǒng)計結(jié)果顯示，與PTZ組比較，F(xiàn)A以劑量依賴性方式降低了PTZ點燃誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡率（F=402.01，P＜0.01）。不同濃度的FA對PTZ致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響見圖2。

圖1 FA對癲癇大鼠癲癇行為的影響（n=12）Fig.1 Effect of FA on epileptic behavior in epileptic rats

圖2 Hochest 33258染色法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡的結(jié)果Fig.2 Hochest 33258 staining method for detecting apoptosis of hippocampal neurons in each group

2.3 WesternBlot法檢測海馬組織中Bcl-2和Bax的表達 與PTZ組相比，生理鹽水組和FA組Bcl-2蛋白表達均顯著增加（F=27.66，P＜0.001）；與PTZ組相比，生理鹽水組和FA組Bax蛋白表達顯著降低（F=62.13，P＜0.001），且隨著濃度的增加顯著性增強（圖3）。

3 討論

圖3 各組大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax的表達結(jié)果（n=6）Fig.3 Expression of Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats in each group

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的慢性疾病，并且影響全世界至少5 000萬人[13]。PTZ點燃大鼠模型模擬人類顳葉癲癇特征：海馬萎縮，邊緣區(qū)域神經(jīng)元丟失。最近，許多科學(xué)家使用點燃模型來研究癲癇的神經(jīng)生物學(xué)，并評估新療法[14-15]和認知缺陷的有效性[16]。在各類化合物中，天然存在的酚類已引起關(guān)注，尤其是FA。許多研究[17-18]報道了FA對腦損傷、腦缺血和阿爾茨海默病樣病理改變的神經(jīng)保護作用，然而，F(xiàn)A對癲癇腦損傷的保護作用報道極少。因此，筆者研究了FA在戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型中的神經(jīng)保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)FA組與PTZ組相比，Racine評分顯著降低，癲癇發(fā)作顯著減少。且隨著濃度的增加，顯著性增加。結(jié)果表明，F(xiàn)A有效地抑制了PTZ點燃小鼠癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度。對癲癇的發(fā)作具有明顯的改善作用，與REN等[8]的研究結(jié)果一致。

Hochest 33258染色結(jié)果顯示，與PTZ組相比，高、中、低劑量FA組可減輕由癲癇導(dǎo)致的細胞凋亡，且隨著FA濃度的增加，凋亡率減低，說明FA可通過減輕細胞凋亡對細胞起保護作用。

為探討FA抗細胞凋亡的具體途徑，本研究進一步檢測了細胞凋亡的相關(guān)因子Bcl-2和Bax的表達。Bcl-2家族蛋白由促進或抑制細胞凋亡的成員組成，Bax是Bcl-2基因家族的成員，與Bcl-2形成異源或同源二聚體，Bax和Bcl-2作為促凋亡調(diào)節(jié)因子和抗凋亡調(diào)節(jié)因子參與多種細胞活動。如果Bax的相對量高于Bcl-2，作為凋亡激活劑起作用，則會促進細胞死亡。相反如果Bcl-2的相對量高于Bax，從而抑制細胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，與PTZ組相比，F(xiàn)A組Bcl-2蛋白表達明顯增加，而Bax蛋白表達明顯減低，這些結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[19-20]。且隨FA濃度增加或減低顯著性增強。

本研究表明，PTZ點燃模型中FA治療可顯著降低強直-陣攣性抽搐和抽搐持續(xù)時間，延長其爆發(fā)的潛伏期，減少海馬CA1區(qū)細胞凋亡以及在海馬CA1區(qū)下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2的表達。提示FA可能通過抗細胞凋亡從而減少神經(jīng)元細胞的損失。但FA的抗凋亡機制有待進一步研究，下一步筆者將選擇多個凋亡因子，探討具體的凋亡路徑。總之，本研究表明FA對PTZ誘導(dǎo)的癲癇腦損傷具有神經(jīng)保護作用。這種保護作用可能是由抗細胞凋亡機制介導(dǎo)的。FA可作為預(yù)防癲癇的有效神經(jīng)保護劑。