鄧慧 周揚(yáng) 徐巖 楊靜 扶超 屠偉峰

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科（廣州510010）；2第74集團(tuán)軍醫(yī)院麻醉科（廣東惠州516008）

帕瑞昔布鈉是一種非甾體類抗炎藥，可以選擇性抑制環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）。COX-2是合成前列腺素（prostaglandin，PG）的重要限速酶之一，炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。COX-2抑制劑治療炎性疼痛已廣為人知，但是其作用于神經(jīng)病理性疼痛的機(jī)理尚不清楚。神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)和（或）繼發(fā)性損害或功能障礙引起的疼痛，機(jī)制十分復(fù)雜[1]。研究表明COX-2可能對NP的早期發(fā)展起重要作用[2]，帕瑞昔布鈉可以緩解神經(jīng)病理性疼痛[3]。同時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“免疫細(xì)胞”，在神經(jīng)損傷后參與各種免疫炎癥反應(yīng)，抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活可以有效防治NP[4]。COX-2是否能通過抑制脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞活化而緩解治療NP，目前國內(nèi)外尚缺乏相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究。本研究通過術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉，擬探討COX-2抑制劑對神經(jīng)病理性疼痛中脊髓層面膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，以期為非甾體類抗炎藥抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組SPF級雄性SD大鼠50只（180～220 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分為4組：正常對照組（NC組，n=5）、假手術(shù)對照組（SC組，n=15）、L5脊神經(jīng)結(jié)扎模型組（SNL組，n=15）、帕瑞昔布鈉治療組（PAR組，n=15）。SC組和SNL組術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射生理鹽水20 μL，PAR組術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射40 μg/μL的帕瑞昔布鈉-生理鹽水溶液10 μL，然后用10 μL生理鹽水沖洗。并在術(shù)前、術(shù)后第1、3、7 d測量PWT（paw withdrawal threshold，PWT），術(shù)后第1、3、7 d取大鼠脊髓腰膨大，免疫組織化學(xué)染色觀察Iba-1和GFAP蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，自然照明，自由飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器GFAP（GA5）Mouse mAb抗體（3670T，CST）；Monoclonal Anti-iba1抗體（SAB2702364，SIGMA）；GTVisionTMⅢ抗鼠兔通用型免疫組化檢測試劑盒（GK500705，基因科技股份有限公司）；觸覺測量套件Von Frey纖維絲；注射用帕瑞昔布鈉（40 mg）（美國輝瑞制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20080045；PE-10導(dǎo)管（寧波安來科技有限公司）；BX-51顯微鏡（Olympus公司）。

1.3 鞘內(nèi)置管與L5脊神經(jīng)結(jié)扎（L5 spinal nerve ligation，SNL）模型制備 無菌條件下對大鼠行鞘內(nèi)置管：麻醉，將PE-10管平行插入L3-4棘間孔2 cm，大鼠出現(xiàn)甩尾反射且導(dǎo)管內(nèi)見清亮的腦脊液流出，然后用生理鹽水沖管后熱熔封管固定。5d后鞘內(nèi)注射2%利多卡因15 μL，并用15 μL生理鹽水沖洗，若出現(xiàn)雙后肢運(yùn)動麻痹，并且在30 min內(nèi)恢復(fù)正常，則視為置管成功。置管成功的大鼠參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行SNL造模，麻醉后暴露并部分咬除左側(cè)L5橫突，游離L5背根神經(jīng)，并以6-0絲線結(jié)扎。術(shù)后進(jìn)行PWT測試，剔除運(yùn)動功能障礙和未出現(xiàn)觸覺痛敏的大鼠。SC組暴露L5神經(jīng)5 min但不結(jié)扎；NC組無任何處理。

1.4 機(jī)械縮足反射閾值測量根據(jù)CHAPLAN[6]的方法，實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于透明玻璃箱中30 min使之適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。用von Frey纖維絲測定（PWT），0.008、0.02、0.04、0.07、0.16、0.40、0.60、1.0、1.4，共9個(gè)刻度刺激大鼠足底皮膚。出現(xiàn)縮足反應(yīng)（如舔足、抬腿等）時(shí)記為陽性反應(yīng)X，無反應(yīng)記為O。如若刺激有陽性反應(yīng)，則選擇低一級別的纖維絲，如果沒有反應(yīng)則選擇高一級別的纖維絲。當(dāng)反應(yīng)出現(xiàn)陽性反應(yīng)與隱性反應(yīng)交替出現(xiàn)，則開始記錄反應(yīng)模式，并再測4次即可。將實(shí)驗(yàn)記錄的數(shù)據(jù)輸入電腦，計(jì)算PWT。行為測試需采用盲法。

1.5 取材及免疫組織化學(xué)染色分別對各組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用10%福爾馬林和生理鹽水進(jìn)行灌注取脊髓腰膨大，4℃固定24 h后石蠟包埋切片。切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)后，封閉后4℃抗體孵育過夜。所用一抗為鼠抗-GFAP（1∶100，Cell Signaling Technology）；鼠抗-Iba1（1∶400，Sigma）。滴加二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用STATA13.1統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械縮足反射閾值變化造模前各組間PWT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；造模后，SNL組、PAR組PWT明顯下降（P＜0.01），提示機(jī)械痛敏產(chǎn)生。且在本實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間以內(nèi)（術(shù)后1～7 d），SNL組PWT持續(xù)低于SC組（P＜0.01）。PAR組給藥后第1天仍明顯低于SC組（P＜0.01）；第3天與SNL組相比PWT明顯升高（P＜0.05），第7天時(shí)與SC組比較無差異。見圖1。

圖1 術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉對SNL誘導(dǎo)的機(jī)械性痛覺過敏的影響Fig.1 The effect of intrathecal Parecoxib on mechanical hypersensensitivity induced by SNL

2.2 脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞變化見圖2～3，SNL造模后小膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓背角被誘導(dǎo)激活（見圖2A）。與SC組相比，SNL組造模后第1、3、7天脊髓背角Iba-1蛋白表達(dá)大量上調(diào)（P＜0.05）。而PAR組脊髓背角Iba-1蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。

2.3 脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞變化SNL造模后星型膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓背角被誘導(dǎo)激活（圖4A）。與SC組相比，SNL組造模后第1、3天脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.01），第7天恢復(fù)正常。給藥后第1、3、7天，PAR組脊髓背角GFAP蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.01），與SC組比較均無差異。見圖4～5。

圖2 術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉對SNL模型大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞IBA-1蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of Parecoxib in the activation of microglia induced by SNL

圖3 術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉對SNL大鼠脊髓背角中IBA-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of Parecoxib in the expression of IBA-1 protein

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用SNL模型[5]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在造模后24 h內(nèi)，術(shù)側(cè)后足PWT值降低，產(chǎn)生機(jī)械性痛敏，并在實(shí)驗(yàn)時(shí)間1～7 d內(nèi)維持較低水平，提示SNL手術(shù)誘導(dǎo)了快速明顯的機(jī)械痛覺過敏。造模后24 h，脊髓背角Iba-1蛋白表達(dá)上調(diào)，第3天達(dá)到高峰并逐漸降低，說明SNL造?？梢哉T導(dǎo)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。而脊髓背角GFAP蛋白在第1天開始表達(dá)，并在第7天恢復(fù)正常，說明SNL造模也可以誘導(dǎo)脊髓背角星型膠質(zhì)細(xì)胞活化。這與OBATA等報(bào)道SNL模型可以導(dǎo)致PWT下降及膠質(zhì)細(xì)胞（星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）活化[7-8]結(jié)果一致，說明造模成功。

本實(shí)驗(yàn)按文獻(xiàn)記載實(shí)驗(yàn)劑量及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]，通過術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射40 μg/μL的帕瑞昔布鈉-生理鹽水溶液10 μL，觀察到NP早期鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉后Iba-1和GFAP蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，膠質(zhì)細(xì)胞活化受到抑制，并且術(shù)側(cè)后足PWT升高，明顯減輕了由SNL誘導(dǎo)的痛覺過敏，緩解了NP急性期疼痛。帕瑞昔布鈉是第一個(gè)可注射COX-2特異性選擇抑制劑[10]?？梢匝杆俦凰獬煞サ匚舨?，通過特異性抑制COX-2阻斷花生四烯酸合成PG而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，被廣泛用于手術(shù)后中重度疼痛。以此推測，在NP早期抑制COX-2表達(dá)可以通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化來緩解NP急性疼痛。

圖4 術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉對SNL模型大鼠脊髓星型膠質(zhì)細(xì)胞GFAP蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of Parecoxib in the activation of Astrocyte induced by SNL

圖5 術(shù)后即刻鞘內(nèi)注射帕瑞昔布鈉對SNL大鼠脊髓背角中GFAP蛋白表達(dá)的影響Fig.5 The effect of Parecoxib in the expression of GFAP protein

研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞P38信號途徑激活將啟動轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB（nuclear factor κB），合成釋放IL-1β、IL-6以及COX-2。這些細(xì)胞因子通過自分泌的方式放大小膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用，并直接作用于背角神經(jīng)元使其電活動異常，導(dǎo)致痛敏形成[11]。炎性細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的突觸傳遞長期改變，并參與NP的發(fā)生與發(fā)展，而膠質(zhì)細(xì)胞是炎性因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要來源[12-13]。以往文獻(xiàn)證明神經(jīng)損傷可以明顯激活膠質(zhì)細(xì)胞，并且上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的促炎性細(xì)胞因子的水平，而注射激活的膠質(zhì)細(xì)胞可以使正常大鼠產(chǎn)生NP[14]。本實(shí)驗(yàn)中，給予COX-2抑制劑帕瑞昔布鈉后，顯著抑制了膠質(zhì)細(xì)胞活化。以此，我們可以推測COX-2作為炎癥反應(yīng)中的重要介質(zhì)，抑制COX-2來抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是帕瑞昔布鈉緩解急性NP的機(jī)制之一。

研究表明，COX-2可以促進(jìn)PGE2合成，大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，其巨噬細(xì)胞的COX-2表達(dá)上調(diào)引起PGE2增多，而注射特異性COX-2抑制劑NS-398 可以下調(diào)PGE2，并且阻斷NP[15]。PGE2 在炎性痛和神經(jīng)病理性痛中發(fā)揮重要作用，生理狀態(tài)下，腦脊液中可以檢測到PGE2的釋放[16]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥刺激可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)PGE2合成和釋放增加，在體外應(yīng)用P物質(zhì)會檢測到膠質(zhì)細(xì)胞中的PGE2釋放，說明PGE2會在膠質(zhì)細(xì)胞中釋放。另有實(shí)驗(yàn)表明，PGE2可以誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），同時(shí)促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，參與NP[17]?？梢酝茰y抑制COX-2，可能使膠質(zhì)細(xì)胞中PGE2合成釋放減少，并且炎性因子下調(diào)，從而阻斷了痛敏的形成。

本實(shí)驗(yàn)僅從NP發(fā)生早期觀察COX-2抑制劑對脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的作用，而COX-2抑制劑是否對NP的維持以及其在慢性期是否產(chǎn)生同樣作用仍需探索。綜上所述，基于前期文獻(xiàn)報(bào)道與我們的實(shí)驗(yàn)研究，帕瑞昔布鈉緩解了NP急性期疼痛，其機(jī)制可能與抑制脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的活化，以及神經(jīng)免疫反應(yīng)的激活有關(guān)，這為COX-2抑制劑治療神經(jīng)病理性疼痛提供了新的依據(jù)。