蔣海兵 王偉 盤(pán)箐 李國(guó)慶

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院1消化內(nèi)科，2腫瘤科（湖南衡陽(yáng)421001）；3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院病原生物與免疫學(xué)教研室（湖南永州425100）

胃癌是源自胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其病死率居中國(guó)惡性腫瘤的第2位，可見(jiàn)對(duì)人們的生命健康有嚴(yán)重威脅，且發(fā)病率尚未見(jiàn)下降趨勢(shì)。自噬是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞降解過(guò)程，也是近年來(lái)生命研究的熱點(diǎn)。正常情況下，細(xì)胞自噬有利于維持自身穩(wěn)態(tài)，但發(fā)生放化療、缺血缺氧等情況下，細(xì)胞自噬又能起到抑制細(xì)胞癌變、保護(hù)細(xì)胞器和蛋白質(zhì)的作用。同時(shí)也有研究認(rèn)為，在腫瘤生長(zhǎng)的早期階段，自噬機(jī)制能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[1]。

目前報(bào)道已有30余種不同的自噬相關(guān)蛋白參與自體吞噬過(guò)程[2]。ATG4蛋白醇是半胱氨酸蛋白水解酶，在促進(jìn)自噬體成熟中起主要功能性作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自噬相關(guān)蛋白4A（autophagy associated protein 4A，ATG4A）也是半胱氨酸肽酶的一種，是自噬發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子，而且參與其他疾病調(diào)控[3]。此外，ATG4A也被證明在卵巢癌的預(yù)后中具有重要作用，以及在腫瘤干細(xì)胞特性維持方面具有重要意義[4]，然而ATG4A在胃癌中的作用尚不明確。本研究通過(guò)對(duì)胃癌細(xì)胞采用劃痕試驗(yàn)、Transwell小室試驗(yàn)、Western Blot等方法進(jìn)行檢測(cè)，研究ATG4A對(duì)胃癌細(xì)胞干性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（pithelial mesenchymal transition，EMT）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Model 2300），SDS-PAGE蛋白電泳槽（Bio-Rad公司），倒置相差顯微鏡（CMK40-F200型，Olymqus公司），超純水儀（Milliipnre公司），DMEM-F12培養(yǎng)基（Gibeo公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fcrmcntan公司），封閉用山羊血清（武漢boster生物技術(shù)公司），RIPA蛋白裂解液（江蘇beyotime生物公司），BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（Thermo公司），兔抗人Oct4、Sox2抗體（Abc公司），兔鼠抗人ATG4A、GAPDH抗體（Samta Cruz公司），小鼠抗人Bmi-1、vimentin、E-cadherin抗體（BD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后置于培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃、5%CO2），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)不同胃癌細(xì)胞株（SGC-7901、MGC-803、MGC-823、MKN-47），待細(xì)胞融合度大概90%時(shí)進(jìn)行傳代及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒對(duì)ATG4A進(jìn)行過(guò)表達(dá)、敲除過(guò)表達(dá)或抑制ATG4A的慢病毒被克隆至PLvx和PLKO.1載體中，克隆和病毒生產(chǎn)是由藥科美生物科技有限公司完成，包括載體構(gòu)建，病毒包裝等。對(duì)于過(guò)表達(dá)ATG4A，將SGC-7901細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右換液，于含有6 μg/mL Polybrene培養(yǎng)基中加入病毒混懸液培養(yǎng)24 h。而對(duì)于抑制ATG4A表達(dá)，三株ATG4A shRNA慢病毒和對(duì)照慢病毒載體被感染到MGC-803中，然后細(xì)胞在無(wú)抗生素培養(yǎng)基中恢復(fù)48 h，培養(yǎng)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或抑制ATG4A的細(xì)胞；將胃癌細(xì)胞株分為為：對(duì)照組（干擾及過(guò)表達(dá)ATG4A空白載體組）、干擾組（Sh-ATG4A-1、2、3）、過(guò)表達(dá)組（ATG4A-OE）。

1.2.3 劃痕試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代接種入6孔板內(nèi)（密度1×105個(gè)/mL），等待細(xì)胞長(zhǎng)滿后采用PBS清洗，沿孔板底部劃一條直線，PBS清洗后，加入（含5 mg/L Mitomycin和10%血清）DMEM培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下拍攝并確定劃痕邊緣區(qū)域及相對(duì)距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)將Matrigel膠稀釋后鋪于Transwell小室上層內(nèi)（冰上操作），室溫過(guò)夜。取在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞按照1×105/孔，種入24孔板Transwell中，孵育過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，Transwell小室的上室加入200 μL細(xì)胞懸液，而將500 μL含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入至Transwell下室內(nèi)。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛固定Transwell小室底面細(xì)胞。結(jié)晶紫染色10 min，PBS漂洗，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞球的培養(yǎng)取生長(zhǎng)良好胃癌細(xì)胞（密度2×104個(gè)/mL）接種于超低粘附的6孔板中，加入含 EGF 20 ng/mL及B27（1×）的DMEM/F12的干細(xì)胞培養(yǎng)基，以獲取腫瘤球。2周后，采用顯微鏡（200×）觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)ATG4AmRNA表達(dá)水平按照總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)分別提取各組胃癌細(xì)胞總RNA及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，取2 μL cDNA用于RT-qPCR反應(yīng)，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析：樣品的相對(duì)表達(dá)用 2-ΔΔCt表示。

1.2.7 WesternBlot檢測(cè) 收集不同組胃癌細(xì)胞后，用預(yù)冷PBS溶液清洗，加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液后冰浴，高速離心，對(duì)上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加適量一抗anti-ATG4A（1∶400）、antisox2（1∶500）、anti-oct4（1∶400）、anti-Bmi-1（1∶400）、anti-vimentin（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）在4℃孵育過(guò)夜后，加入過(guò)氧化物酶（HRP）結(jié)合二抗（1∶2 000）室溫震蕩孵育2 h，經(jīng)ECL顯色后膠片曝光顯影，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。先進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞株中ATG4A高、低表達(dá)的篩選由圖1可見(jiàn)，RT-qPCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，MGC-803中ATG4A表達(dá)量最高，而SGC-7901中ATG4A表達(dá)最低。

2.2 干擾與過(guò)表達(dá)ATG4A菌株鑒定對(duì)胃癌細(xì)胞MGC-803干擾ATG4A表達(dá)后，與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組中ATG4A蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）；而對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901過(guò)表達(dá)ATG4A后，與CTAL相比，ATG4A-OE組中ATG4A蛋白表達(dá)明顯上升（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 胃癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)比較劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾 ATG4A 表達(dá)后，CTAL、ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組胃癌細(xì)胞MGC-803劃痕修復(fù)率分別為（81.45±7.52）%、（53.54±4.69）%、（60.76±5.47）%、（55.80±5.21）%，與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組劃痕修復(fù)率明顯下降（均P＜0.05）。同樣，CTAL、ATG4AOE組胃癌細(xì)胞SGC-7901的劃痕修復(fù)率分別為（45.65±5.60）%、（70.12±8.65）%，與CTAL組相比，ATG4A-OE組劃痕修復(fù)率明顯上升（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖2 干擾與過(guò)表達(dá)ATG4A菌株鑒定Fig.2 Identification of ATG4A strain with overexpression and Interference

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾ATG4A 表達(dá)后，CTAL、ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組胃癌細(xì)胞MGC-803的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（282 ± 30）、（190 ± 24）、（142 ± 19）、（202 ± 26），與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降（均P＜0.05）。同樣，CTAL、ATG4A-OE組胃癌細(xì)胞SGC-7901的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（182±28）、（266±44），與CTAL組相比，ATG4A-OE組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯上升（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖3 胃癌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)比較Fig.3 Comparison of scratch tests on gastric cancer cells

2.5 胃癌細(xì)胞成球培養(yǎng)比較成球培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾ATG4A 表達(dá)后，CTAL、ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組胃癌細(xì)胞MGC-803的每個(gè)視野成球直徑在40～100 μm之間的個(gè)數(shù)分別為（50±8）、（28±5）、（31±6）、（33±8）。與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組成球細(xì)胞數(shù)明顯下降（均P＜0.05）；同樣，CTAL、ATG4A-OE組胃癌細(xì)胞SGC-7901的成球細(xì)胞數(shù)分別為（12±2）、（17±3）。與CTAL組相比，ATG4A-OE組成球細(xì)胞數(shù)明顯上升（P＜0.05）。

圖4 胃癌細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)Fig.4 Detection of invasive ability of gastric cancer cells

2.6 WesternBlot檢測(cè)胃癌細(xì)胞干性標(biāo)志物及EMT相關(guān)信號(hào)分子的影響 由圖5A可知，干擾ATG4A表達(dá)后，與CTAL組比較，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組胃癌細(xì)胞株MGC-803中SOX-2、OCT-4、Bmi-1蛋白表達(dá)明顯下降（均P＜0.05）。而過(guò)表達(dá) ATG4A后，與CTAL組比較，ATG4A-OE組胃癌細(xì)胞株SGC-7901中SOX-2、OCT-4、Bmi-1蛋白表達(dá)明顯上升（均P＜0.05），見(jiàn)圖5B。

由圖5C可知，干擾ATG4A表達(dá)后，與CTAL組比較，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組胃癌細(xì)胞株MGC-803中E-cad表達(dá)上升，Vim、N-cad表達(dá)下降（均P＜0.05）。而過(guò)表達(dá)ATG4A后，與CTAL組比較，ATG4A-OE組胃癌細(xì)胞株SGC-7901中E-cad表達(dá)下降，Vim、N-cad表達(dá)增加（均P＜0.05），見(jiàn)圖5D。

3 討論

ATG4A是自噬發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵分子，屬于半胱氨酸肽酶的一種，且參與其他疾病調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)選取5個(gè)細(xì)胞株采用Western blot及RT-qPCR法驗(yàn)證不同分化程度的胃癌細(xì)胞系中ATG4A分子表達(dá)差異，結(jié)果顯示，高分化胃癌細(xì)胞SGC-7901低表達(dá)ATG4A分子，而低分化胃癌細(xì)胞MGC-803高表達(dá)ATG4A。

圖5 westernblot檢測(cè)ATG4A對(duì)胃癌細(xì)胞干細(xì)胞特性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白的影響Fig.5 The effect of ATG4A on the stem cell properties and epithelial-mesenchymal transformation protein of gastric cancer cells detected by Western Blot

目前研究分子生物學(xué)的一種重要方法是進(jìn)行干擾或者過(guò)表達(dá)，RNA干擾是真核生物體內(nèi)由雙鏈RNA介導(dǎo)的降解同源RNA的現(xiàn)象，是特異性抑制靶基因表達(dá)的一種方法，廣泛應(yīng)用于基因功能研究，其作用主要是基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行調(diào)控[5]。在本課題研究中，構(gòu)建了3個(gè)干擾序列（Sh-ATG4A-1、Sh-ATG4A-2、Sh-ATG4A-3）及一個(gè)過(guò)表達(dá)序列（ATG4A-OE），以及相應(yīng)的空白載體，這部分實(shí)驗(yàn)由生物公司完成，還包括進(jìn)行病毒包裝、轉(zhuǎn)染等進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)選擇MGC-803細(xì)胞進(jìn)行干擾，即調(diào)低ATG4A表達(dá)，而對(duì)SGC-7901細(xì)胞進(jìn)行ATG4A過(guò)表達(dá)，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)，研究ATG4A表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的影響。

在衡量腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為方面，遷移能力具有重要意義。有研究指出腫瘤細(xì)胞遷移能力與其惡性程度較為一致，遷移能力代表細(xì)胞在體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)能力，受到細(xì)胞自身因素及機(jī)體等因素影響[6]。本研究劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示，與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組劃痕修復(fù)率明顯下降，同樣與CTAL組相比，ATG4A-OE組劃痕修復(fù)率明顯上升，這表明ATG4A能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移能力；在腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力檢測(cè)上，Transwell小室檢測(cè)法因重復(fù)性高，簡(jiǎn)便易行，是目前廣泛被接受細(xì)胞侵襲模型。在本實(shí)驗(yàn)中，與CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯下降，同樣與CTAL組相比，ATG4A-OE組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯上升，這表明ATG4A能夠增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲能力。

在腫瘤組織中，有相當(dāng)一部分具有自我更新能力和異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞亞群，被稱為腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC），其在侵襲中的作用是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移研究的重要內(nèi)容[7-9]。日益增多的實(shí)驗(yàn)支持CSC學(xué)說(shuō)，腫瘤干細(xì)胞通過(guò)無(wú)限增殖和自我更新能力促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，具有較強(qiáng)新轉(zhuǎn)移灶的克隆形成能力、遷徙能力以及運(yùn)動(dòng)能力，但腫瘤干細(xì)胞干性在某些因素刺激下能夠增強(qiáng)，或者減弱，并非所有細(xì)胞干性一致[10-11]。成球能力是判定細(xì)胞干性一個(gè)重要的方面，研究中發(fā)現(xiàn)，與 CTAL組相比，ShATG4A-1、ShATG4A-2、ShATG4A-3組成球細(xì)胞數(shù)明顯下降，同樣與CTAL組相比，ATG4A-OE組成球細(xì)胞數(shù)明顯上升。這表明干擾ATG4A表達(dá)后，胃癌細(xì)胞成球能力下降，而過(guò)表達(dá)后，其成球能力增強(qiáng)；在本研究中我們選取干細(xì)胞特性的蛋白標(biāo)志物SOX-2，OCT-4，BMI-1進(jìn)行研究，Western Blot檢測(cè)也證實(shí)，干擾ATG4A表達(dá)后，胃癌細(xì)胞株MGC-803干性標(biāo)志物SOX-2、OCT-4、Bmi-1表達(dá)明顯下降，而過(guò)表達(dá)ATG4A后，胃癌細(xì)胞株SGC-7901干性標(biāo)志物SOX-2、OCT-4、Bmi-1表達(dá)明顯上升。這表明ATG4A能夠影響胃癌細(xì)胞干性，進(jìn)而調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，同時(shí)也是指上皮細(xì)胞通過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的過(guò)程[12-13]。在EMT過(guò)程中，許多蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了變化，如間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如神經(jīng)性鈣黏著蛋白（N-cadherin），波性蛋白（Vimentin）表達(dá)量上升，而上皮細(xì)胞標(biāo)志物如上皮性鈣黏著蛋白（E-cadherin）表達(dá)量下降[14]。在本研究中，干擾ATG4A表達(dá)后，與CTAL組比較，各干擾組MGC-803細(xì)胞中Vimentin，N-cadherin蛋白表達(dá)下降，E-cadherin蛋白表達(dá)上升，這表明胃癌細(xì)胞出現(xiàn)EMT下降現(xiàn)象，同時(shí)其侵襲轉(zhuǎn)移能力下降；同樣過(guò)表達(dá)ATG4A后，與CTAL組比較，ATG4A-OE組SGC-7901細(xì)胞中N-cadherin，Vimentin蛋白表達(dá)增加，E-cadherin蛋白表達(dá)下降（均P＜0.05），這說(shuō)明過(guò)表達(dá)ATG4A具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT作用，以及增強(qiáng)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，目前研究ATG4A與胃癌細(xì)胞間關(guān)系的報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)劃痕、Transwell小室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ATG4A與腫瘤細(xì)胞分化程度呈負(fù)相關(guān)，還能夠影響胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。通過(guò)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ATG4A能影響胃癌細(xì)胞干性及EMT，實(shí)現(xiàn)對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，筆者將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)此問(wèn)題開(kāi)展研究。