盛旭東 李文 張俊鋒 王輝 許剛柱
西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1神經(jīng)外科,2醫(yī)療質(zhì)量控制科(西安710077)
膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見,病死率最高的惡性腫瘤,具有較強(qiáng)的放化療抵抗。因此,如何提高膠質(zhì)瘤患者對化療藥物的敏感性,尋找更有效的治療靶點逐漸成為膠質(zhì)瘤術(shù)后輔助治療的重點。聯(lián)用替莫唑胺(temozolomide,TMZ)與生物靶向藥物以提高腫瘤療效和降低毒性反應(yīng)是近年來的研究熱點之一[1-2]。癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(CEACAM1)在多種腫瘤中具有調(diào)節(jié)增殖、影響血管生成等作用[3]。筆者前期的實驗研究表明干擾CEACAM1基因表達(dá)可抑制SHG44膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。本實驗利用siRNA技術(shù)降低人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞中CEACAM1的表達(dá),探討將CEACAM1作為靶點進(jìn)行基因治療的可行性,為膠質(zhì)瘤的綜合治療提供新的思路。
1.1 材料人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞由本實驗室保存,Lipofectamine2000(美國 Invitrogen公司),RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液與胎牛血清(美國HyClone公司),RT-PCR試劑盒(日本Takara公司),CCK-8試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司),F(xiàn)ITCAnnexinV凋亡檢測試劑盒(美國Invitrogen公司),CEACAM1單克隆抗體(美國Epitomics公司);GAPDH單克隆抗體(北京賽諾博公司),替莫唑胺(江蘇天士力公司)。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的設(shè)計與合成以CEACAM1基因為靶基因,采用網(wǎng)上設(shè)計軟件(http://sirna.wi.mit.edu/)來設(shè)計siRNA。其中CEACAM1基因siRNA序列以 5′-CAGCCACAGAAAUAAUUUATT-3′作為正義鏈,以5′-UAAAUUAUUUCUGUGGCUGTT-3′作為反義鏈;陰性對照siRNA序列以5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′作為正義鏈,以 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′作為反義鏈。由上海生物工程公司合成。
1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組將人腦膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI1640中,置于5%CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),貼壁生長24 h后轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。實驗分為正常對照組(無干預(yù)措施)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)及siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染CEACAM1基因siRNA)。
1.2.3 Real time PCR檢測SHG44細(xì)胞CEACAM1基因表達(dá)收集轉(zhuǎn)染48 h后的SHG44細(xì)胞,Trizol一步法抽提細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后用特異引物擴(kuò)增內(nèi)參和目的條帶,并進(jìn)行對比。引物序列如下:GADPH上游5′-TTGGTATCGTGGAAGGAC-3′,下游 5′-CAGTAGAGGCAGGGATGA-3′;CEACAM1上游5′-CCACAGTCACAGGAGATAAG-3′,下游5′-AAGACCTCACACCAATACG-3′。用2-ΔΔCt方法分析處理實時定量數(shù)據(jù),計算CEACAM1 mRNA的表達(dá)差異。實驗重復(fù)3次,取平均值。
1.2.4 CCK-8實驗檢測CEACAM1siRNA轉(zhuǎn)染對細(xì)胞增殖及化療敏感性的影響細(xì)胞接種于96孔板,于轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)24、48、72 h,每組設(shè)5個平行孔,每孔滴加已配好的CCK-8溶液10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,以酶標(biāo)儀于450 nm處讀取吸光度A值,計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。另外將接種于96孔板的細(xì)胞加入轉(zhuǎn)染混合液后,立即加入不同濃度TMZ(10、20、40、80 μg/mL),每個劑量組設(shè)5個平行孔,繼續(xù)在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,加入CCK-8后于酶標(biāo)儀450 nm處檢測A值。
1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染前24 h以每孔1×106個細(xì)胞接種于96孔板中,轉(zhuǎn)染及TMZ處理步驟同前,每組設(shè)5個平行孔,48 h后胰酶消化,收集細(xì)胞,按照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,流式細(xì)胞儀檢測分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)方法利用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較應(yīng)用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNA后對CEACAM1mRNA表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染48 h后,正常對照組CEACAM1 mRNA表達(dá)相對值(0.79±0.08),而siRNA干擾組CEACAM1 mRNA表達(dá)相對值為(0.31±0.07),顯著低于正常對照組(P<0.01)。正常對照組和陰性對照組兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),見圖1、表1。
圖1 RT-PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染后CEACAM1 mRNA的表達(dá)Fig.1 The expression of CEACAM1 mRNA after siRNA transfection by RT-PCR
表1 各組細(xì)胞中CEACAM1 mRNA相對值比較Tab.1 The comparison of CEACAM1mRNA relative values in different groups of cells ±s
表1 各組細(xì)胞中CEACAM1 mRNA相對值比較Tab.1 The comparison of CEACAM1mRNA relative values in different groups of cells ±s
注:與正常對照組比較,#P>0.05;*P<0.01
分組CEACAM1 mRNA相對值正常對照組陰性對照組siRNA干擾組0.79±0.08 0.83±0.10#0.31±0.07*
2.2 CEACAM1siRNA對膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞增殖的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h,siRNA干擾組SHG44細(xì)胞的增殖抑制率顯著高于正常對照組(P<0.01),而正常對照組與陰性對照組SHG44細(xì)胞體外增殖能力之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。
表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較Tab.2 The comparison of cell proliferation inhibition rates in each group ± s,%
表2 各組細(xì)胞增殖抑制率比較Tab.2 The comparison of cell proliferation inhibition rates in each group ± s,%
組別正常對照組陰性對照組siRNA干擾組24 h抑制率0 5.72±0.87 13.36±1.53 48 h抑制率0 5.45±0.76 27.28±2.48 72 h抑制率0 2.35±0.82 38.08±2.64
2.3 CEACAM1 siRNA對SHG44細(xì)胞TMZ敏感性的影響轉(zhuǎn)染后加入不同濃度TMZ處理各組細(xì)胞,48 h后酶標(biāo)儀檢測結(jié)果顯示,各組SHG44細(xì)胞的吸光度值均呈下降趨勢(表3)。其中采用80 μg/mL TMZ對轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA后的SHG44細(xì)胞進(jìn)行處理,其增殖抑制率可達(dá)57.5%,顯著高于未經(jīng)TMZ處理的正常對照組。正常對照組、陰性對照組與siRNA干擾組SHG44細(xì)胞TMZ的IC50值分別為(37.16 ± 5.12)、(36.50 ± 4.68)和(19.34 ± 3.27)μg/mL。siRNA干擾組IC50值明顯降低,與正常對照組、陰性對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);正常對照組與陰性對照組的IC50值之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明干擾CEACAM1表達(dá)能抑制SHG44細(xì)胞增殖并提高其化療敏感性。
表3 干擾CEACAM1表達(dá)對TMZ處理后SHG44細(xì)胞增殖抑制的影響Tab.3 The interference of inhibits proliferation SHG44 cells by CEACAM1 expression after TMZ treatment ± s,μg/mL
表3 干擾CEACAM1表達(dá)對TMZ處理后SHG44細(xì)胞增殖抑制的影響Tab.3 The interference of inhibits proliferation SHG44 cells by CEACAM1 expression after TMZ treatment ± s,μg/mL
注:與正常對照組比較,#P>0.05;*P<0.01
組別正常對照組陰性對照組siRNA干擾組0μg/mL 0.452±0.021 0.436±0.026#0.247±0.023*10μg/mL 0.425±0.027 0.418±0.035#0.238±0.021*20μg/mL 0.363±0.024 0.361±0.070#0.216±0.040*40μg/mL 0.220±0.029 0.217±0.032#0.202±0.025*80μg/mL 0.211±0.026 0.215±0.038#0.192±0.044*
2.4 TMZ對轉(zhuǎn)染CEACAM1siRNA后SHG44細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測顯示,轉(zhuǎn)染CEACAM1 siRNA的SHG44細(xì)胞在TMZ(80 μg/mL)作用48 h后凋亡率為(23.61±3.64)%,顯著高于正常對照組(11.65±2.38)%和陰性對照組(12.37±2.92)%(P<0.01);與未經(jīng)TMZ處理的siRNA干擾組(16.27±2.25)%相比較,也是明顯增加(P<0.01)。經(jīng)過TMZ處理的正常對照組和陰性對照組凋亡率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4、圖2。
表4 FCM測定TMZ對轉(zhuǎn)染CEACAM1siRNA細(xì)胞凋亡率的影響Tab.4 The interference of TMZ on apoptosis rate of CEACAM1siRNA cells transfected by FCM x ± s,%
圖2 3組SHG44細(xì)胞凋亡率比較Fig.2 The comparison of apoptosis rates in 3 groups of SHG44 cells
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是一種惡性的原發(fā)性腦腫瘤,對常規(guī)療法具有高度抗性。TMZ是此類患者的一線治療藥物,但這些患者的生存率很低,其中一個很重要的原因就是腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性降低,產(chǎn)生耐藥性[5-6]。因此,探討如何提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞化療敏感性,對于改善此類患者的生存質(zhì)量具有十分重要的臨床意義。為了減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的抵制,很多學(xué)者進(jìn)行相關(guān)研究。有研究[7]表明honokiol可以通過內(nèi)在的線粒體依賴性機(jī)制增強(qiáng)TMZ誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而殺滅神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。PAZHOUHI等[8]發(fā)現(xiàn)TMZ和thymoquinone(TQ)聯(lián)合應(yīng)用對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有協(xié)同細(xì)胞毒作用,顯著降低了膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性,同時使膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9表達(dá)水平降低。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與基因異常導(dǎo)致的細(xì)胞分化失調(diào)關(guān)系密切[9-11]。本團(tuán)隊前期的實驗研究表明腦膠質(zhì)瘤中CEACAM1表達(dá)上調(diào),CEACAM1與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),其表達(dá)可影響腫瘤生物學(xué)行為[12]。進(jìn)一步深入探討和研究CEACAM1與膠質(zhì)瘤化療敏感性的關(guān)系,能夠加深對該基因特性的了解,為判斷能否將CEACAM1作為膠質(zhì)瘤基因治療的靶點提供一定的依據(jù)。
在本實驗中,合成針對CEACAM1的特異性siRNA,對SHG44細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染,RT-PCR檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后SHG44細(xì)胞中CEACAM1基因表達(dá)顯著降低,提示CEACAM1基因表達(dá)被抑制。CCK-8實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后24、48、72 h,siRNA干擾組的SHG44細(xì)胞增殖抑制率高于同時間點正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。另外的細(xì)胞培養(yǎng)實驗表明,采用不同濃度TMZ對CEACAM1 siRNA轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)siRNA干擾組的增殖較未轉(zhuǎn)染的正常對照組細(xì)胞明顯減慢。此外,siRNA干擾組SHG44細(xì)胞對TMZ的IC50值明顯降低,提示CEACAM1 siRNA可提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對TMZ的敏感性。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,CEACAM1siRNA轉(zhuǎn)染后SHG44細(xì)胞凋亡率明顯高于正常對照組、陰性對照組,三組細(xì)胞在應(yīng)用TMZ處理后凋亡率都有所增加,其中siRNA組的凋亡率可達(dá)到(23.61±3.64)%,顯著高于未經(jīng)TMZ處理的siRNA干擾組和經(jīng)TMZ處理的正常對照組SHG44細(xì)胞,說明CEACAM1siRNA與TMZ聯(lián)合作用可顯著促進(jìn)膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的凋亡。
本實驗在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中通過應(yīng)用RNA干擾技術(shù)并結(jié)合TMZ治療,阻礙了膠質(zhì)瘤SHG44細(xì)胞的增殖過程,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并且抑制CEACAM1表達(dá)可以提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的化療敏感性,從而為臨床治療膠質(zhì)瘤提供了新的思路及實驗依據(jù)。然而本實驗只是針對SHG44細(xì)胞一個細(xì)胞株進(jìn)行的研究,有研究報道在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞株中,如 U251、U373、SNB19,雖然種屬相同但其對化療藥物的敏感性不盡相同[13],下一步實驗尚需在其它膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中進(jìn)行進(jìn)一步的檢測,更加深入探討CEACAM1在膠質(zhì)瘤中的改變對TMZ化療效果的影響及其機(jī)制。