平貫芳，郗玉玲，鄧智建

肺癌是最常見的惡性腫瘤，也是全世界癌癥死亡的首要病因[1-2]。近年來由于空氣嚴(yán)重污染，中國肺癌的發(fā)病率逐年增加。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的85%[3-4]。目前雖然對(duì)肺癌的治療已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究，但其治療生存率仍然很低[5-6]。血小板衍生生長(zhǎng)因子受體( platelet-derived growth factor receptors，PDGFR)是酪氨酸蛋白激酶家族的重要成員，具有細(xì)胞趨化、增殖、遷移、侵襲和信號(hào)傳導(dǎo)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移性癌患者中PDGFR的過度表達(dá)，阻斷PDGFR功能，可降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[7]。目前，由于PDGFR在腫瘤細(xì)胞存活和信號(hào)傳導(dǎo)方面有重要作用，已成為研發(fā)抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)[8]。CP-673451是一種選擇性PDGFR抑制劑，其抗腫瘤的能力及機(jī)制尚不明確，本文旨在討論CP-673451對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的侵襲和遷移等惡性生物學(xué)行為的影響，為非小細(xì)胞肺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室購于BD公司；選擇性PDGFR抑制劑CP-673451(用二甲基亞砜配成10 μmol·L-1母液，臨用前用RPMI1640稀釋成工作濃度)購自美國Selleck Chemicals公司；RPMI1640及胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞裂解液RIRP試劑盒購自美國Sigma公司；一抗p-Akt(Ser473)、p-p70S6K(Thr389)、p-S6(Ser235/236)、p-GSK-3β(Ser9)、p70S6K、GSK-3β、PDGFRβ(28E1)、p-PDGRα(Tyr849)/PDGFβ(Tyr857[C43E9])、p-Bad(Ser136[D25H8])、抗β-肌動(dòng)蛋白，二抗辣根過氧化物酶購自美國Cell signal technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞株A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 遷移實(shí)驗(yàn)Transwell法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞接種于Boyden chamber(Costar?; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)上室，隨機(jī)分為對(duì)照組和CP-673451組，分別加入1%胎牛血清(FBS)，下室加入650 μL含有10%FBS培養(yǎng)基作為趨化因子，CP-673451組上室細(xì)胞加入25、100或400 nMCP-673451孵育12 h，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，固定細(xì)胞，加入0.1%結(jié)晶紫染色，清除未遷移細(xì)胞，對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行拍照。加入10%醋酸進(jìn)行細(xì)胞裂解，于595 nm比色法測(cè)定吸光度。劃痕法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，隨機(jī)分為對(duì)照組和CP-673451組。待細(xì)胞鋪滿后，用10 μL無菌槍頭劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，CP-673451組分別加入濃度為25、100、400 nMCP-673451，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，劃痕拍照。

1.3.2 侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)考察細(xì)胞侵襲能力。24-transwell Boyden chamber上室均勻涂1 mg·ml-1的MatrigelTM基質(zhì)膠，37 ℃下放置4 h。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液加入24-transwell Boyden chamber上室，隨機(jī)分為對(duì)照組和CP-673451組，下室加入650 μL培養(yǎng)基10%FBS作為趨化因子，CP-673451組上室分別加入濃度為25、100、400 nMCP-673451，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱孵12 h，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，清除未遷移的細(xì)胞，遷移的細(xì)胞進(jìn)行拍照，加入10%醋酸進(jìn)行細(xì)胞裂解，于595 nm比色法測(cè)定吸光度。

1.3.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞，消化后調(diào)整密度為1×105個(gè)·mL-1細(xì)胞懸液接種于蓋玻片上，隨機(jī)分為對(duì)照組和CP-673451組，CP-673451組加入濃度為25、100、400 nMCP-673451在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，用4%多聚甲醛PBS在室溫固定30 min，用PBS在室溫漂洗3次，每次10 min，用0.1% Triton X-100的PBS在室溫通透化處理20 min，用PBS在室溫漂洗3次，每次10 min，并與5%正常血清封閉30 min。經(jīng)四甲基異硫氰酸羅丹明培養(yǎng)30 min，采用熒光顯微鏡對(duì)肌動(dòng)蛋白纖維進(jìn)行拍照。

1.3.4 Western印跡實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞裂解液RIRP裂解經(jīng)CP-673451處理A549細(xì)胞，提取的蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗孵育過夜、洗滌，加入二抗孵育2 h，化學(xué)顯影及定影。

2 結(jié)果

2.1 CP-673451對(duì)A549細(xì)胞遷移、侵襲的影響遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示25、100、400 nMCP-673451均可抑制A549細(xì)胞遷移能力。Transwell法對(duì)A549細(xì)胞的抑制率分別為56.34%、68.72%和84.56%，且成濃度依賴性，結(jié)果見圖1(A、B)，劃痕法對(duì)A549細(xì)胞的抑制率分別為34.62%、65.27%和81.56%，均呈濃度依賴性，結(jié)果見圖1(C、D)。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示25、100、400 nMCP-673451均能有效抑制A549細(xì)胞的侵襲能力，抑制率分別為42.23%、67.89%和89.72%，呈劑量依賴性，結(jié)果見圖1(E、F)。由于在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中片狀偽足形成起重要作用，免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CP-673451顯著抑制A549細(xì)胞偽足形成，提示CP-673451能抑制腫瘤細(xì)胞的能動(dòng)性，抑制率分別為57.21%、78.92%和89.22%，呈濃度依賴性，結(jié)果見圖1(G、H)。

A、B：CP-673451對(duì)A549細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及抑制率的影響；C、D：CP-673451對(duì)A549細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及抑制率的影響；E、F：CP-673451對(duì)A549細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)及抑制率的影響；G、H：CP-673451對(duì)A549細(xì)胞對(duì)肌動(dòng)蛋白纖維形成和抑制率的影響。圖1 CP-673451對(duì)A549細(xì)胞板狀偽足形成、細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.2 CPCP-673451抑制PDGFR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濃度為1、2、4 μMCP-673451均能有效抑制A549細(xì)胞的PDGFR的下游信號(hào)傳導(dǎo)，抑制Akt、GSK-3β、p70S6和S6蛋白的磷酸化，且呈濃度依賴性，且治療后的總蛋白水平比較無顯著變化。見圖2。

圖2 CP-673451抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中CP-673451路PDGFR介導(dǎo)的信號(hào)通路

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)PDGFR在腫瘤細(xì)胞的遷移和增殖中發(fā)揮著重要的作用，PDGFR激活和過量表達(dá)有助于腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[9-10]。因此，抑制PDGFR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路是治療癌癥的一個(gè)新的方向。PDGFR在細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)換中起重要作用，PDGFR抑制劑可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和浸潤。CP-673451是一種選擇性PDGFRα/β抑制劑，比作用于其他血管生成受體選擇性高450倍以上，有別于多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，減少了多靶點(diǎn)制劑的不良反應(yīng)[11]。目前CP-673451能有效抑制裸鼠肺癌、結(jié)腸癌移植腫瘤的生長(zhǎng)，但體外研究對(duì)肺癌細(xì)胞尤其是非小細(xì)胞肺癌的影響較少。本研究觀察了CP-673451對(duì)體外非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。研究結(jié)果顯示，CP-673451能有效抑制肺癌細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞偽足形成、遷移和侵襲，推測(cè)PDGFR對(duì)非小細(xì)胞肺癌信號(hào)傳導(dǎo)有抑制作用。

PDGFRα和PDGFRβ是受體酪氨酸激酶，二聚化的PDGF配體與受體結(jié)合，能夠誘導(dǎo)PDGFR二聚化和胞妹酪氨酸殘基磷酸化，介導(dǎo)下游信號(hào)傳導(dǎo)，PI3K/AKT信號(hào)通路是一條PDGF激活的重要信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、分化等功能[12-14]，PI3K/AKT信號(hào)通路的失調(diào)在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)生比例較高，影響了癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示CP-673451抑制了A549細(xì)胞Akt、GSK-3β、p70S6和S6蛋白的磷酸化，且呈濃度依賴性。CP-673451對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抗癌活性可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，提示CP-673451在外的抗腫瘤作用是通過抑制Akt信號(hào)通路產(chǎn)生的。本研究結(jié)果進(jìn)一步完善了CP-673451抗瘤譜及抗腫瘤分子機(jī)制，為其進(jìn)一步研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。