李思敏，張言，高定烽，熊華斌，高云濤

(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，昆明 650500)

白花酸藤果為紫金?？扑崽僮訉僦参?，又名牛脾蕊(廣東)、羊公板仔(海南島)、水林果、槍子果(云南)、馬桂郎(云南傣語)，分布于廣東、海南、云南等地，生長在海拔50～2000 m的林內(nèi)、灌木叢、路邊，在云南普洱、思茅等地均可見。民間以其根(中藥名：咸酸)、果(藏藥名：齊當(dāng)嘎)入藥，治婦女閉經(jīng)、小兒頭瘡、跌打損傷、絳蟲等[1]。隨著生活水平的提高，人們對食品保健和營養(yǎng)價(jià)值的關(guān)注度越來越高。信維平[2]從果蔬中分離出抗氧化物質(zhì)，可對飲料調(diào)味和作為預(yù)防癌癥等疾病的功能性食品。農(nóng)仲文等[3]通過對山竹果皮中活性物質(zhì)做浸泡酒的研究，發(fā)現(xiàn)酒中活性成分高，抗氧化作用好。楊占南等[4]對魚腥草作為酒的調(diào)味品進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)酒中含有豐富的營養(yǎng)及藥理成分物質(zhì)，具有保健功能。但是，鮮見對白花酸藤果浸泡酒的研究報(bào)道。本試驗(yàn)在單因素分析基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法對白花酸藤果浸泡酒的抗氧化活性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步開發(fā)利用白花酸藤果浸泡酒調(diào)味提供了理論技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)所用白花酸藤果：購自云南省普洱市，該地區(qū)屬于低緯高原南亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。

95%乙醇(分析純)、乙醇(優(yōu)級純)、DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)：美國Sigma公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SJIA-2012型超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 寧波雙嘉儀器有限公司；8453型紫外可見分光光度計(jì) 美國安捷倫公司；FA2004型電子分析天平 上海上平儀器有限公司；水浴鍋 力辰科技有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白花酸藤果提取物最大吸收峰的測定

按照液固比為10∶1(mL/g)的比例加入95%的乙醇，取3.0 g的白花酸藤果，置于60 ℃水浴中萃取2 h，以4000 r/min離心萃取液10 min，靜置后取上清液，備測。備測樣品均用對應(yīng)的溶劑稀釋50倍，再進(jìn)行200～800 nm的光譜掃描，得到白花酸藤果溶液的吸收光譜和最大吸收峰。

1.3.2 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH的清除效果

準(zhǔn)備200 mL的燒杯，并準(zhǔn)確稱取6份3.0 g的白花酸藤果置于其中，再配制酒精體積分?jǐn)?shù)為0%、10%、30%、50%、70%、95%的液體，按液固比為10∶1加入液體和白花酸藤果，瓶口以保鮮膜封口，置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計(jì)算溶液對DPPH的清除率。

1.3.3 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個(gè)200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比為10∶1并以保鮮膜封口后置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取出燒杯，設(shè)置超聲時(shí)間為20 min，分別以超聲功率150，300，450，600，750，900 W提取，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計(jì)算溶液對DPPH的清除率。

1.3.4 不同超聲時(shí)間的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個(gè)200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比為10∶1以保鮮膜封口后置于60 ℃的水浴中浸提2 h，然后取出燒杯，設(shè)置超聲功率為900 W，分別設(shè)置超聲時(shí)間為5，10，20，30，40，50，60 min進(jìn)行提取，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計(jì)算溶液對DPPH的清除率。

1.3.5 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

取6個(gè)200 mL的燒杯，并精確稱取3.0 g的白花酸藤果共6份分別置于其中，按液固比(mL/g) 5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1加入95%的乙醇開展實(shí)驗(yàn)，以保鮮膜進(jìn)行封口，每個(gè)平行組均置于60 ℃水浴中浸提2 h，然后取濾液離心，離心條件與1.3.1中相同。取10 mL配制好的DPPH(A=0.7±0.1)溶液于比色管中，加入0.5 mL的白花酸藤果濾液，測定其吸光度，并計(jì)算溶液對DPPH的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物的最大吸收峰

圖1 提取物的最大吸收峰Fig.1 The maximum absorption peak of extracts

由圖1的UV-Vis吸收光譜掃描結(jié)果可知，白花酸藤果溶液的吸收光譜在300～800 nm之間并沒有吸收峰，DPPH溶液在328，517 nm處出現(xiàn)2個(gè)較強(qiáng)的特征吸收峰，而白花酸藤果溶液在202 nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的特征吸收峰。所以本試驗(yàn)選用的白花酸藤果溶液的最大吸收波長為202 nm。

2.2 不同提取溫度的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖2 不同提取溫度的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.2 The effect of Embelia ribes solution with different extraction temperatures on DPPH free radical scavenging

由圖2可知，在整個(gè)提取溫度區(qū)間的白花酸藤果溶液對DPPH的影響隨提取溫度的升高而升高，即提取溫度對白花酸藤果提取的影響是逐步上升的。但60 ℃之后的白花酸藤果溶液，隨著提取溫度的升高，清除率的變化速率減慢。如對綠茶多糖體外抗氧化活性的研究顯示，提取溫度不但會影響多糖的提取率，而且會影響多糖的抗氧化活性[5]。這主要是因?yàn)樵S多抗氧化物質(zhì)對溫度都比較敏感，在高溫條件下容易導(dǎo)致活性的降低。所以，考慮到白花酸藤果浸泡酒的保健價(jià)值，本研究在后續(xù)步驟中選用60 ℃作為提取溫度。

2.3 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH的清除效果

圖3 白花酸藤果乙醇浸泡液對DPPH自由基的清除Fig.3 The effect of ethanol soaking solution of Embelia ribes on DPPH free radical scavenging

在10∶1的液固比、60 ℃的水浴條件下加熱2 h，研究了不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對DPPH清除的影響。由圖3可知，隨著液體中乙醇含量的增加，在50%～100%內(nèi)，清除率呈上升趨勢，證明用乙醇對白花酸藤果進(jìn)行浸泡，能使白花酸藤果內(nèi)的抗氧化成分析出，其析出效果遠(yuǎn)高于水。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于70%時(shí)，有略微下降趨勢，這是由于某些有效成分溶于水，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，提取液對DPPH的清除率會略微降低。由于生活中常見的酒度數(shù)多為50度左右，這種酒浸泡調(diào)味后不但具有較好的飲用口感[6,7]，而且廣受消費(fèi)者歡迎。故本試驗(yàn)選用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液作為浸提液。

2.4 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖4 不同液固比的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.4 The effect of Embelia ribes solution with different liquid-solid ratios on DPPH free radical scavenging

由圖4可知，液固比在10∶1～30∶1，清除率隨液固比的增加呈下降趨勢，液固比在10∶1時(shí)對DPPH的清除率達(dá)到最大值，液固比大于10∶1時(shí)，清除率反而隨液固比的增加而顯著變化，這是由于隨著白花酸藤果占比減小，溶解增加，白花酸藤果溶液的濃度越來越低，提取液中的有效成分被稀釋，所以清除率下降。

2.5 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖5 不同超聲功率的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.5 The effect of Embelia ribes solution with different ultrasonic power on DPPH free radical scavenging

許多研究顯示，超聲技術(shù)有助于植物提取過程中抗氧化物質(zhì)的釋放[8]，增加抗氧化物質(zhì)的利用價(jià)值，故本研究對超聲輔助提取白花酸藤果的各參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。由圖5可知，超聲功率在整個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)的清除率呈整體上升趨勢。相對于超聲功率為600～900 W時(shí)的清除率上升較為緩慢。

2.6 不同超聲時(shí)間的白花酸藤果溶液對DPPH的清除效果

圖6 不同超聲時(shí)間的白花酸藤果溶液對DPPH自由基的清除Fig.6 The effect of Embelia ribes solution with different ultrasonic time on DPPH free radical scavenging

在液固比10∶1、超聲功率900 W的條件下，研究了不同超聲時(shí)間對DPPH清除的影響。由圖6可知，在10～40 min，隨著超聲時(shí)間的延長，清除率呈直線上升趨勢；當(dāng)時(shí)間超過40 min后清除率出現(xiàn)下降趨勢，可能是在超聲功率900 W、超聲時(shí)間40 min后對白花酸藤果的組織結(jié)構(gòu)造成破碎現(xiàn)象[9]，白花酸藤果原有的色素融入了試液中，增加了色素積累，導(dǎo)致清除率降低。

2.7 超聲輔助提取的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.7.1 CCD設(shè)計(jì)及其試驗(yàn)結(jié)果

本研究利用響應(yīng)面分析建立了影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，從而選擇出最優(yōu)工藝[10]。在探究對DPPH清除的過程中，適當(dāng)超聲的引入有利于提高乙醇對白花酸藤果有效物質(zhì)的浸出，從而使清除率增加，由此可見，超聲功率是構(gòu)建白花酸藤果乙醇浸出物對DPPH清除的關(guān)鍵性因素，故選取超聲功率作為響應(yīng)面分析的影響因素。此外，在單因素試驗(yàn)中，一定范圍內(nèi)的超聲功率和超聲時(shí)間對清除率的影響較為顯著，故將其作為響應(yīng)面分析的影響因素。因此，采用Design Expert 8.1.6軟件中的Central Composite Design(CCD)法對清除體系中超聲功率、超聲時(shí)間和提取溫度對DPPH清除率的影響進(jìn)行探究。根據(jù)CCD設(shè)計(jì)原理，超聲功率、超聲時(shí)間和提取溫度各設(shè)置3個(gè)水平，見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助清除DPPH試驗(yàn)的因素與水平值Table 1 The factors and levels of ultrasound-assisted DPPH scavenging test optimized by response surface method

根據(jù)CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以超聲功率、超聲時(shí)間和提取溫度3個(gè)因素作為自變量A，B，C，以白花酸藤果乙醇的浸出物對DPPH的清除率作為響應(yīng)值R，通過Design Expert 8.1.6分析軟件獲得的試驗(yàn)方案及采用該方案獲得的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 CCD experimental design and experimental results

續(xù) 表

2.7.2 回歸和方差分析

以白花酸藤果乙醇浸出物對DPPH的清除率為響應(yīng)值，在響應(yīng)面分析軟件中對超聲功率、超聲時(shí)間和提取溫度進(jìn)行回歸擬合，響應(yīng)值R清除率與各影響因子間的回歸方程為：

R清除率=90.90+4.28A+1.23B-2.95C+0.050AB+2.60AC+2.40BC-4.68A2-3.83B2-1.22C2。

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9495。此外，對回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3。

表3 清除DPPH回歸方差分析結(jié)果Table 3 The results of regression variance analysis of DPPH scavenging

注：“*”表示P<0.05；“**”表示P<0.01；“***”表示P<0.001。

所建立模型的P<0.0001，具有極顯著性；失擬項(xiàng)的P>0.1，無顯著性，由此可見，所建模型可用于色素提取的響應(yīng)面分析。此外，A、C、AC、BC、A2、B2、C2項(xiàng)的P值均小于0.05，表現(xiàn)出顯著性，這表明超聲功率、超聲時(shí)間和提取溫度均為清除DPPH過程中影響清除率的主要因素，其中，A、A2、B2項(xiàng)的P<0.001，即超聲功率和超聲時(shí)間對DPPH清除率的影響極為顯著，而C項(xiàng)的P<0.01，表明提取溫度對DPPH清除率的影響效果要明顯弱于超聲功率和超聲時(shí)間。BC、C2項(xiàng)的P<0.05，這表明超聲時(shí)間和提取溫度對DPPH清除率的影響在一定程度上表現(xiàn)出交互作用，而其他因素間則無此效應(yīng)。

2.7.3 響應(yīng)面分析

超聲功率(A)、超聲時(shí)間(B)和提取溫度(C)3 個(gè)因素對DPPH清除的3D響應(yīng)面圖(a，b，c)見圖7。

圖7 各因素及其交互作用對超聲輔助提取影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagrams of the influence of various factors and their interactions on ultrasound- assisted extraction

由圖7中a可知，在B因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說明超聲時(shí)間對DPPH清除率的影響較小，隨超聲時(shí)間的增加，色素提取有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著，而沿A因素方向則出現(xiàn)了較為明顯的變化，響應(yīng)面曲線較陡，超聲功率引起清除率的變化較大，說明超聲功率對DPPH清除率的影響大于超聲時(shí)間。

圖7中b則顯示了A因素(超聲功率)和C因素(提取溫度)對DPPH清除率的影響。由 3D響應(yīng)面圖可知，在A因素方向響應(yīng)面曲線有一定的坡度，但是在C因素方向，響應(yīng)面曲線較為平緩，說明提取溫度對DPPH清除率的影響較小，隨著提取溫度的增加，對DPPH清除率有增加的趨勢，但增加的程度并不大，影響并不十分顯著。由此可見，A因素變化對結(jié)果的影響要高于C因素，即相對于提取溫度，超聲功率的影響更大。

由圖7中c可以比較 B因素(超聲時(shí)間)和C因素(提取溫度)對DPPH清除率的影響。由兩因素3D響應(yīng)面圖中響應(yīng)面曲線的陡峭程度可以看出，B，C兩因素的影響也存在較大差異，相對于超聲時(shí)間，提取溫度的影響較弱一些。響應(yīng)面分析直觀反映了各因素的影響情況，其效果優(yōu)于單因素試驗(yàn)，綜合分析可以發(fā)現(xiàn)，3個(gè)因素對清除率的影響有所不同，其程度大小為：超聲功率>超聲時(shí)間>提取溫度。

此外，通過響應(yīng)面分析模型對DPPH清除率條件進(jìn)行了優(yōu)化分析，預(yù)測的最優(yōu)條件是超聲功率617 W、超聲時(shí)間38 min、提取溫度50 ℃，預(yù)測的最優(yōu)清除率為92.86%。通過試驗(yàn)檢驗(yàn)最優(yōu)預(yù)測條件下的提取效果，清除率與預(yù)測值相接近，達(dá)到90.9%，相差僅1.96%，說明該方案是可行的[11]。通過引入超聲技術(shù)和對參數(shù)的優(yōu)化，白花酸藤果的自由基清除率得到了明顯的改善，這與核桃抗氧化肽和雪蓮薯多糖的研究結(jié)果相一致[12,13]。

2.8 白花酸藤果浸泡酒的GC-MS分析

本研究采用氣相色譜儀對白花酸藤果浸泡液以及浸泡液清除DPPH自由基的成分進(jìn)行了分析，并利用氣質(zhì)色譜聯(lián)用儀[14]對色譜中出現(xiàn)的各峰進(jìn)行了解析，結(jié)果見表4和表5。白花酸藤果在色譜級的乙醇中浸泡24 h的氣相色譜圖見圖8。

表4 白花酸藤果溶液成分分析 Table 4 Component analysis of Embelia ribes solution

表5 加入白花酸藤果后的DPPH自由基成分分析Table 5 DPPH free radical component analysis after adding Embelia ribes

圖8 白花酸藤果溶液氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of Embelia ribes

由圖8和表4可知，從浸泡液中分離出了3種物質(zhì)。把浸泡液加入DPPH自由基溶液中的氣相色譜圖見圖9，從中分離出了2種物質(zhì)。表5顯示在10 mL DPPH自由基中加入500 μL的浸泡液，相對于浸泡酒的氣相色譜峰有2種物質(zhì)的氣相色譜峰消失，分別為葉綠醇、棕櫚酰胺，并且也有新物質(zhì)二苯胺的氣相色譜峰出現(xiàn)。從氣質(zhì)圖中可以看出浸泡液中的很多成分都可以使DPPH自由基分解。

圖9 加入白花酸藤果后的DPPH自由基氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of DPPH free radical after adding Embelia ribes

3 結(jié)論

白花酸藤果浸泡酒提取的最優(yōu)條件是液固比10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲功率617 W、超聲時(shí)間38 min、提取溫度50 ℃。使白花酸藤果浸泡酒的抗氧化作用充分發(fā)揮，有利于提高酒的風(fēng)味。

響應(yīng)面優(yōu)化后預(yù)測的最優(yōu)清除率為92.86%，通過實(shí)驗(yàn)測得的清除率為90.9%，與預(yù)測值僅相差1.96%。

白花酸藤果浸泡酒中含有較高的抗氧化活性成分，有利于清除人體內(nèi)雜余自由基，可作為特色優(yōu)勢資源進(jìn)一步開發(fā)利用。