卿勇軍， 劉 文， 杜 平， 姚曉艷， 金 陽， 石 亞， 陳淮臣， 何 利

[1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 貴州 貴陽550000； 2. 國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州） 制藥有限公司， 貴州 貴陽550000； 3. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 貴州 貴陽550002]

戊己胃漂浮緩釋片是課題組將經(jīng)典名方戊己丸結(jié)合現(xiàn)代藥用高分子材料及新制劑技術(shù)進(jìn)行劑型改革, 制備的新型胃漂浮緩釋制劑, 其抗炎抗胃潰瘍等作用較傳統(tǒng)戊己丸更加顯著, 具有使用方便、 可定時(shí)定位釋放藥物的特點(diǎn)[1]。 中藥譜效關(guān)系已廣泛用于中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究[2-4], 但關(guān)于新制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)分析相對(duì)較少。 本實(shí)驗(yàn)采用不同產(chǎn)地來源的原藥材提取制備干浸膏后制備不同批次的新制劑戊己胃漂浮緩釋片, 通過建立制劑的指紋圖譜并比較其主要成分的差異, 同時(shí)對(duì)不同批次制劑的抗胃潰瘍藥效作用進(jìn)行評(píng)價(jià)； 采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法[5-7]建立指紋圖譜共有峰（以峰面積計(jì)） 與抗胃潰瘍藥效作用指標(biāo)表皮生長(zhǎng)因子（EGF） 的譜效關(guān)系模型[8-10], 最終確定其主要藥效成分, 為科學(xué)闡明新制劑戊己胃漂浮緩釋片的抗胃潰瘍作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀、 DAD 型紫外-可見光檢測(cè)器（美國(guó)安捷倫公司）； TDP-5 型單沖壓片機(jī)（長(zhǎng)沙市岳麓區(qū)中南制藥機(jī)械廠）； Auy220 型電子天平（日本島津公司）； SK8210HP 型臺(tái)式超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； HC-2062 型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）； HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）； TB-1-1 型電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）； 酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）； 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海簡(jiǎn)戶儀器設(shè)備股份有限公司）。

1.2 試藥 對(duì)照品鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201212）、 鹽酸巴馬汀 （批號(hào)110732-201309）、 鹽酸藥根堿 （批號(hào)110733-201108）、 吳茱萸堿（批號(hào)110802-201409）、 吳茱萸次堿（批號(hào)110801-201207）、 吳茱萸內(nèi)酯（批號(hào)110800-20120）、 芍藥苷（批號(hào)110736-201640）, 均購于中國(guó)食品藥品檢定研究院； 黃連堿（批號(hào)GZDD-0426）、 表小檗堿（批號(hào)GZDD-0833）、 芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)GZDD-0690）, 均購于貴州迪達(dá)科技有限責(zé)任公司。 乙腈（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 磷酸二氫鉀（西隴化工股份有限公司）； 其他試劑均為分析純。 復(fù)方丙谷胺西咪替丁片 （批號(hào)5170202, 東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司）； EGF 試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司, HL20040, 96T）； 娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）。

黃連、 吳茱萸、 白芍藥材購于國(guó)內(nèi)不同藥材市場(chǎng)或者藥店, 見表1, 不同產(chǎn)地及品種黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.、 三角葉黃連Coptis deltoidea C. K.Cheng et Hsiao 或云連Coptis teeta Wall. 的干燥根莖, 吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa （Juss.） Benth.、石 虎 Euodia rutaecarpa （ Juss.） Ben -th. var. officinalis（Dode） Huang 或 疏 毛 吳 茱 萸Euodia rutaecarpa （Juss.）Benth. var. bodinieri （Dode） Huang 的干燥近成熟果實(shí), 白芍為毛莨科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根, 經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)周漢華教授鑒定為正品。 11 批戊己胃漂浮緩釋片由本實(shí)驗(yàn)室制備。

表1 樣品信息

1.3 動(dòng)物 健康新西蘭家兔, 體質(zhì)量2 ～2.5 kg, 雌雄各半, 均由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)0201602。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿3.06 mg、 鹽酸巴馬汀4.69 mg、 鹽酸藥根堿5.43 mg、 黃連堿4.06 mg、 表小檗堿5.38 mg、 吳茱萸內(nèi)酯5.25 mg、 吳茱萸堿4.64 mg、吳茱萸次堿4.45 mg、 芍藥內(nèi)酯苷5.25 mg、 芍藥苷4.98 mg, 分別置于10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 作為對(duì)照品母液冷藏備用。 依次精密吸取各母液2.60、 2.00、0.20、 0.50、 0.60、 0.20、 0.20、 0.10、 0.68、 1.20 mL,置于同一10 mL 棕色量瓶中, 加甲醇至刻度, 即得, 冷藏備用。

2.2 供試品溶液制備 取11 批戊己胃漂浮緩釋片適量,充分研磨, 分別精密稱取0.1 g, 置具塞錐形瓶中, 分別精密加入25 mL 甲醇, 稱定質(zhì)量, 超聲提取30 min, 放冷,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量, 搖勻, 過0.45 μm 微孔濾膜, 取續(xù)濾液, 即得。

2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX 色 譜 柱 XDB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -KH2PO4溶液（B）, 梯度洗脫, 程序見表2； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣時(shí)間55 min； 檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

2.4 抗胃潰瘍藥效指標(biāo)考察

2.4.1 胃潰瘍模型及給藥 除正常對(duì)照組外的各組家兔均灌胃70%乙醇-0.15 mol/L 鹽酸混合溶液以誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生胃潰瘍[11-12], 以1 mL/kg 劑量灌胃相應(yīng)體積混合液。 將家兔隨機(jī)分為以下14 組： 對(duì)照組、 模型組、 陽性組（丙谷胺西咪替丁片）、 11 個(gè)給藥組, 每組6 只, 雌雄各半。

家兔造模后第2 天, 各給藥組給予相應(yīng)受試藥物12 d,正常對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水, 戊己胃漂浮緩釋片按人體劑量（以60 kg 計(jì)） 換算為0.400 g/kg； 陽性組為0.027 g/kg, 其間正常喂予由動(dòng)物提供中心配送的標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2.4.2 血清及胃組織液中EGF 檢測(cè) 家兔治療結(jié)束后,禁食不禁水24 h, 采用5 mL 注射器于家兔耳中央動(dòng)脈取血（取血前先剔除家兔耳中央動(dòng)脈血管周圍部分毛發(fā), 然后使用酒精棉反復(fù)擦拭或用手指反復(fù)來回按摩, 使血管擴(kuò)張,緩慢拉動(dòng)抽取, 避免溶血） 約5 mL, 放置于10 mL 離心管中, 室溫靜置20 min 左右, 待離心管上端有血清液分層析出時(shí), 即可轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中離心血液。 家兔取血完成后,采用空氣栓塞法處死, 剪取胃潰瘍瘢痕周圍組織約0.3 g,正常組取同一部位組織, 用適量生理鹽水制成10%組織勻漿液, 兩者均以10 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min, 移液器吸取上清液, 留樣檢測(cè)。

2.5 數(shù)據(jù)處理 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A 版軟件處理圖譜數(shù)據(jù), SPSS16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,各組計(jì)量數(shù)據(jù)資料以示, 當(dāng)資料滿足正態(tài)分布且組間方差齊時(shí), 選用單因素方差分析進(jìn)行處理； 如不滿足上述條件, 則采用非參數(shù)檢驗(yàn), 即秩和檢驗(yàn), 數(shù)據(jù)按α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。 P＜0.05 表示差異顯著, P＜0.01 表示差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 指紋圖譜建立 取11 批戊己胃漂浮緩釋片, 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.3” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 將色譜圖導(dǎo)入相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)分析軟件, 共確定16 個(gè)共有峰, 色譜圖見圖1, 共有模式疊加圖見圖2。 并對(duì)共有峰進(jìn)行定性分析, 結(jié)合對(duì)照品和文獻(xiàn)信息, 結(jié)果見表3。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

圖2 11 批樣品HPLC 指紋圖譜

3.2 EGF 檢測(cè) 由表4 可知, 模型組大鼠血清及胃組織勻漿液中EGF 水平明顯較高, 與對(duì)照組比較差異顯著（P＜0.01）； 11 個(gè)給藥組均能不同程度降低大鼠血清及胃組織勻漿液中EGF 水平, S1、 S2、 S3、 S9、 S10 效果較好, 與模型組和對(duì)照組比較均差異顯著（P＜0.01）。

表3 11 批樣品峰面積

表4 各組EGF 水平比較（ng/mL， n=6）

表4 各組EGF 水平比較（ng/mL， n=6）

注：與模型組比較,△△P＜0.01；與對(duì)照組比較,**P＜0.01

images/BZ_238_236_2295_1194_2353.png對(duì)照組 2 201.23±7.08△△ 2 659.71± 26.77△△模型組 4 694.00±32.96** 4 608.21±15.16**陽性組 3 018.40±12.49△△** 2 827.17±27.19△△**S1 組 3 219.24±21.76△△** 3 451.16±14.21△△**S2 組 2 853.92±19.19△△** 3 415.34±9.16△△**S3 組 3 009.57±13.23△△** 3 152.04±10.52△△**S4 組 3 442.29±17.37△△* 3 585.29±16.76 S5 組 3 953.18±37.72 3 611.94±47.43 S6 組 3 630.10±20.56 3 138.66±34.67△△**S7 組 3 232.33±15.69△△ 3 473.46±12.64△△**S8 組 3 810.45±48.45 3 183.67±24.91△△**S9 組 3 352.85±10.42△△** 3 352.81±12.60△△**S10 組 2 907.11±11.26△△** 3 464.91±26.54△△**S11 組 3 961.21±19.25 3 831.29±10.13

3.3 灰色關(guān)聯(lián)分析

3.3.2 譜效關(guān)系 按關(guān)聯(lián)度大小進(jìn)行排序, 見表5, 可知指紋圖譜中共有峰峰面積與抗胃潰瘍作用藥效指標(biāo)表皮生長(zhǎng)因子 （EGF） 的降低有高度關(guān)聯(lián)性, 關(guān)聯(lián)度均大于0.550 0。 各色譜峰對(duì)藥效指標(biāo)EGF 促進(jìn)作用的貢獻(xiàn)依次為13＞6＞8＞10＞15＞7＞9＞12＞4＞14＞16＞1＞5＞11＞3＞2, 其中13號(hào)峰（鹽酸小檗堿）、 6 號(hào)峰（芍藥苷）、 8 號(hào)峰（表小檗堿）、 10 號(hào)峰（黃連堿）、 15 號(hào)峰（吳茱萸堿） 關(guān)聯(lián)度均在0.750 0 以上, 表明戊己胃漂浮緩釋片抗胃潰瘍是通過有效組分群共同發(fā)揮藥效作用。

表5 關(guān)聯(lián)度測(cè)定結(jié)果

灰色關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn), 5 種藥效成分對(duì)抗胃潰瘍作用的貢獻(xiàn)程度最大, 提示接下來研究的重點(diǎn)方向應(yīng)為制劑體內(nèi)藥效成分作用規(guī)律及機(jī)制[14], 實(shí)現(xiàn)離體與在體實(shí)驗(yàn)相補(bǔ)充、 微觀與宏觀相結(jié)合, 建立更加符合科學(xué)理論的藥效篩選及評(píng)價(jià)體系, 為制劑抗胃潰瘍作用機(jī)制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究開辟新的道路。

4 討論

已有研究表明[15-16], EGF 具有抑制胃酸、 胃蛋白酶的分泌, 降低其對(duì)黏膜的損傷, 抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡, 維持黏膜完整性的作用； 增加胃黏膜的血流量, 促進(jìn)血管生成、結(jié)締組織再生、 黏膜分泌重碳酸鹽, 保護(hù)胃黏膜免受損傷因子破壞； 增加上皮細(xì)胞的合成, 促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)和潰瘍愈合, 減少潰瘍復(fù)發(fā), 是抗炎、 抗胃潰瘍作用的重要機(jī)制之一[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)11 批戊己胃漂浮緩釋片進(jìn)行了HPLC 指紋圖譜分析, 確定了16 個(gè)共有峰, 明確了其中10 個(gè)所代表的化學(xué)成分, 可較好表征制劑成分的信息。 采用灰色關(guān)聯(lián)分析方法建立了共有色譜峰與抗胃潰瘍藥效之間的譜效關(guān)系,表明各共有峰與抗胃潰瘍作用均有不同程度的關(guān)聯(lián)性, 關(guān)聯(lián)度在0.598 7～0.832 6 之間, 其中鹽酸小檗堿、 芍藥苷、表小檗堿、 黃連堿、 吳茱萸堿抗胃潰瘍作用關(guān)聯(lián)度較強(qiáng),進(jìn)一步明確了制劑譜效關(guān)系, 為相關(guān)效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考依據(jù)。