黃 銳， 袁 毅， 袁 淵， 任桂林， 李 志， 鐘振東， 蒲清榮*

（1. 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院， 四川 瀘州646000； 2. 成都里來(lái)生物科技有限公司， 四川 成都610000）

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由嘌呤代謝異常致使單鈉尿酸鹽結(jié)晶沉積到關(guān)節(jié)及其周圍組織, 誘使相關(guān)炎癥細(xì)胞聚集到關(guān)節(jié)周圍發(fā)生吞噬反應(yīng), 從而引起關(guān)節(jié)周圍廣泛的炎癥反應(yīng), 為成年男性常見(jiàn)的炎性關(guān)節(jié)疾病之一[1-2]。 在急性發(fā)作期, 病變關(guān)節(jié)紅腫疼痛劇烈, 滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、 表面充血水腫、 組織局部壞死, 在關(guān)節(jié)積液和周圍組織中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 和白細(xì)胞介素-1β （IL-1β）等均顯著增高[3]。 目前, 臨床上治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的常用藥物秋水仙堿、 非甾體類消炎藥、 糖皮質(zhì)激素雖然療效較好, 但易產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)[4-5], 故尋找相關(guān)中成藥越來(lái)越引起人們的重視。

茜花膠囊是治療痛風(fēng)的經(jīng)驗(yàn)方, 由茜草、 花椒、 通草組成, 具有涼血散瘀、 通絡(luò)止痛、 清熱利尿的功效, 主要用于痛風(fēng)引起的關(guān)節(jié)或肌肉的紅、 腫、 熱、 痛、 麻等癥[6-7], 療效較好, 但其具體抗炎機(jī)制尚不清楚。 因此, 本試驗(yàn)初步探討茜花膠囊在尿酸鈉誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的抗炎作用, 從而為該制劑相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠40 只, 雄性, 體質(zhì)量280 ～320 g, 由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供, 動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（川） 2013-17, IVC 系統(tǒng)喂養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（川） 2013-065], 自由進(jìn)食進(jìn)水。 本實(shí)驗(yàn)所涉及動(dòng)物相關(guān)操作均在西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。

1.2 試藥 茜花膠囊（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室, 批號(hào)20160522）。 別嘌醇（黑龍江澳利達(dá)奈德制藥有限公司, 批號(hào)15120903）； 尿酸鈉（美國(guó)Sigma 公司, 批號(hào)U2875）。 大鼠TNF-α （貨號(hào)xl-Er0359）、 IL-1β （貨號(hào)xl-Er0187） ELISA 試劑盒（英國(guó)Abcam 公司, 鑫樂(lè)生物進(jìn)口分裝）； 尿酸測(cè)定試劑盒（江西特康科技有限公司, 批號(hào)1703103）。

1.3 儀器 Multlskan Mk3 型酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]； RM2016 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī) （德國(guó)Leica 公司）； BA400 Digital 數(shù)碼三目攝像顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）； TC6010L 型全自動(dòng)生化分析儀（江西特康科技有限公司）。

2 方法

2.1 尿酸鈉溶液制備[8]尿酸鈉用PBS 配制成20 mg/mL溶液, 超聲振蕩充分溶解, 使用前180 ℃下滅菌2 h,即得。

2.2 造模及給藥 40 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后, 隨機(jī)分為正常組、 模型組、 別嘌醇組（3.5 mg/kg）[9]、 茜花膠囊組（1.666 9 g/kg）, 每組10 只。 給藥組大鼠每天灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物, 正常組、 模型組大鼠灌胃給予等量生理鹽水,每天1 次, 持續(xù)14 d, 于第12 d 給藥后1 h 開(kāi)始建模。 除正常組外, 各組大鼠乙醚麻醉, 選取右膝關(guān)節(jié)作為穿刺點(diǎn),穿刺者用左手拇指捫及髕骨外側(cè)緣與股骨外側(cè)踝之間的髕骨關(guān)節(jié)間隙, 右手持1 mL 注射器緩慢穿刺進(jìn)針, 有脫空感后回抽出少許關(guān)節(jié)液, 注入0.2 mL 單鈉尿酸鹽溶液, 以關(guān)節(jié)囊對(duì)側(cè)鼓起為注射成功標(biāo)準(zhǔn), 誘導(dǎo)急性關(guān)節(jié)炎模型； 正常組大鼠對(duì)應(yīng)位置注入等量生理鹽水。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 腫脹指數(shù)[10]通過(guò)2 ～3 mm 寬紙條和游標(biāo)卡尺測(cè)量造模前后1、 2、 4、 8 h 關(guān)節(jié)周徑, 計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹指數(shù),公式為腫脹指數(shù)= [（測(cè)定時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)周徑-初始周徑） /初始周徑] ×100%。

2.3.2 TNF-α、 IL-1β、 UA 水平檢測(cè) 造模48 h 后, 大鼠開(kāi)腹下腔靜脈取血3 mL, 保存于普通真空采血管中, 靜置0.5 h, 4 000 r/min 離心10 min, 取血清分裝于1 mL 離心管中, -70 ℃下保存。 ELISA 法檢測(cè)TNF-α、 IL-1β 水平,尿酸測(cè)定試劑盒檢測(cè)尿酸水平。

2.3.3 膝關(guān)節(jié)組織病理變化 造模48 h 取血后取大鼠膝關(guān)節(jié), 4%多聚甲醛固定, 5.5% EDTA 溶液脫鈣, 常規(guī)脫水, 透明, 包埋, 切片, HE 染色, 觀察大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 12.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以） 表示, 組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析, 方差齊采用LSD 檢驗(yàn), 方差不齊采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。 P ＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 茜花膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響 表1 顯示, 與模型組比較, 茜花膠囊組大鼠造模4、 8 h 后關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。

表1 茜花膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響， n=10）

表1 茜花膠囊對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹的影響， n=10）

注：與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

images/BZ_223_236_2532_2244_2631.png模型組 — 28.11±3.6 45.57±4.8 40.57±6.4 30.48±5.8別嘌醇組 3.5 24.64±6.4 35.15±6.2 23.16±3.7** 11.37±3.8**茜花膠囊組 1 666.9 25.01±8.3 39.21±4.5 26.35±5.5* 19.22±6.8**

3.2 茜花膠囊對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化的影響 圖1 顯示, 正常組大鼠關(guān)節(jié)面光滑平整, 滑膜組織正常； 模型組大鼠關(guān)節(jié)面不平整, 偶見(jiàn)表面結(jié)締組織浸潤(rùn)生長(zhǎng), 細(xì)胞排列較為紊亂, 部分軟骨細(xì)胞發(fā)生變性壞死, 可見(jiàn)多重潮線, 軟骨下骨小梁排列規(guī)律, 滑膜組織較為正常, 其中8 例可見(jiàn)滑膜組織細(xì)胞輕度增生, 滑膜內(nèi)不同程度的纖維組織增生, 7 例可見(jiàn)滑膜內(nèi)不同程度的炎細(xì)胞浸潤(rùn), 以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主, 其中3 例有少量巨噬細(xì)胞增多, 其他無(wú)明顯病理變化； 別嘌醇組大鼠關(guān)節(jié)面不平整, 細(xì)胞排列較整齊, 結(jié)構(gòu)清晰, 滑膜組織細(xì)胞、 纖維細(xì)胞有不同程度增生, 滑膜內(nèi)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)； 茜花膠囊組大鼠關(guān)節(jié)面光滑平整, 細(xì)胞排列較為整齊, 結(jié)構(gòu)清晰, 滑膜組織細(xì)胞輕度增生, 滑膜內(nèi)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織病理變化（HE， ×400）

3.3 茜花膠囊對(duì)UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影響 表2 顯示, 與正常組比較, 模型組UA、 TNF-α、 IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較, 茜花膠囊組UA、 IL-1β水平顯著降低（P＜0.05）, 但TNF-α 水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

表2 茜花膠囊對(duì)UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影響， n=10）

表2 茜花膠囊對(duì)UA、 TNF-α、 IL-1β 水平的影響， n=10）

注：與正常組比較,*P＜0.05；與模型組比較,△P＜0.05

images/BZ_224_236_2116_2244_2166.png正常組 — 59.80±9.13 161.04±8.65 14.14±1.32模型組 — 110.11±11.03* 182.52±10.97* 16.49±1.10*別嘌醇組 3.5 75.50±12.15*△ 171.54±7.52*△ 15.06±1.23△茜花膠囊組 1 666.9 84.00±9.50*△ 177.11±11.69* 15.04±1.23△

4 討論

TNF-α、 IL-1β 等炎癥因子在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[11], 并且UA 也是判斷痛風(fēng)的重要臨床指標(biāo), 故本實(shí)驗(yàn)選擇三者作為檢測(cè)指標(biāo)。 結(jié)果表明, 茜花膠囊可快速改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹, 減輕炎細(xì)胞浸潤(rùn)、 巨噬細(xì)胞增生、 滑膜組織增生、 纖維組織增生等病變程度, 有效抑制UA、 IL-1β 水平升高。

目前, 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型建立方法一般采用大鼠踝關(guān)節(jié)注射給藥[12-14], 以及小鼠、 家兔后肢膝關(guān)節(jié)注射給藥[15]。 課題組前期選擇大鼠右踝關(guān)節(jié)注射給藥, 但其關(guān)節(jié)腔較小, 藥物易溢出腔內(nèi), 導(dǎo)致造模不成功, 而且雌鼠對(duì)尿酸代謝的自愈性較強(qiáng)。 因此, 本實(shí)驗(yàn)選擇雄鼠進(jìn)行造模,右膝關(guān)節(jié)注射單鈉尿酸鹽, 即穿刺者用左手拇指捫及髕骨外側(cè)緣與股骨外側(cè)踝之間的髕骨關(guān)節(jié)間隙, 右手持1 mL 注射器緩慢穿刺進(jìn)針, 有脫空感后回抽出少許關(guān)節(jié)液, 打入藥物, 這是造模成功的關(guān)鍵。

膝關(guān)節(jié)腔注射藥物造模時(shí)對(duì)關(guān)節(jié)面損傷較大, 故只適用于局部關(guān)節(jié)癥狀觀察。 造模48 h 后取血時(shí), 關(guān)節(jié)中未見(jiàn)尿酸鹽結(jié)晶, 國(guó)外文獻(xiàn)[16-17] 報(bào)道分別是4、 6 h 后取血, 但也未見(jiàn)尿酸鹽結(jié)晶, 國(guó)內(nèi)大多文獻(xiàn)也未涉及。 結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 推測(cè)茜花膠囊可能具有拮抗尿酸鹽在關(guān)節(jié)腔沉積的作用, 但其是否與該制劑中某些有效部位群有關(guān),作用機(jī)制有哪些尚不明確, 還需進(jìn)一步研究。