周艾強(qiáng)， 關(guān)衛(wèi)兵， 王鳳林， 李 理*， 紀(jì)翠芳， 楊宏志， 謝英華， 章明敏

（1. 廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院， 廣東 廣州510800； 2. 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 廣東 廣州510630；3. ?？谑腥嗣襻t(yī)院， 海南 ?？?70208； 4. 深圳同安藥業(yè)有限公司， 廣東 深圳518000）

近年來隨著生活水平提高、 飲食結(jié)構(gòu)改變, 非酒精性脂肪肝發(fā)病率迅速增加, 而且發(fā)病年齡日趨年輕化, 其中我國為6.3% ～27.0%[1], 已超過病毒性肝炎成為第1 大肝病[2], 嚴(yán)重危害了人民健康。 脂肪肝是一種由多種病因引起的肝臟脂質(zhì)超過肝濕重3%, 或組織學(xué)上30% 以上肝細(xì)胞脂肪變性的病理狀態(tài)[3], 治療方法除了提倡平衡飲食、適量運動外, 目前臨床上采用調(diào)脂、 抗氧化, 但效果不理想； 中藥因其多靶點、 多途徑的特色, 在防治脂肪肝方面取得了顯著療效[4-5]。

克癀膠囊由三七、 黃連、 黃芩、 黃柏、 大黃、 人工牛黃、 人工麝香等組成, 并經(jīng)紅曲發(fā)酵制備, 具有清熱解毒、化瘀散結(jié)的功效, 臨床用于濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)、 瘀血阻絡(luò)證及急慢性肝炎[6], 對非酒精性脂肪肝具有一定療效。 為進(jìn)一步了驗證克癀膠囊藥理作用, 本實驗探討該制劑對非酒精性脂肪肝大鼠的影響。

1 材料

1.1 試藥 克癀膠囊（深圳市同安藥業(yè)有限公司, 批號171003、 180103）； 水飛薊賓膠囊（陽性對照藥1, 天津天士力圣特制藥有限公司, 批號750604050、 750603024）； 多烯磷脂酰膽堿膠囊[陽性對照藥2, 賽諾菲（北京） 制藥有限公司, 批號7BJD031B、 7BJD039B], 實驗時均以純化水配至所需濃度的混懸液。 總膽固醇 （TCH） （批號MS8115）、 甘油三酯（TG） （批號MS8233）、 高密度脂蛋白膽固醇（HDL） （批號MS8247）、 低密度脂蛋白膽固醇（LDL） （批號MS8327） 檢測試劑盒（寧波美康生物科技有限公司）。 丙二醇、 丙酮（廣州化學(xué)試劑廠）； 吐溫80（天津市大茂化學(xué)試劑廠）； 膽固醇（河南一品食化有限公司）； 豬膽鹽 （廣東環(huán)凱微生物科技有限公司, 批號3206086）； 蛋黃粉、 純化水（自制）。

1.2 儀器 UW620H、 TW423L 電子天平 （日本島津公司）； GL224-1SCN 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]； MP12001 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）； BCD-290 W 普通冰箱（青島海爾股份有限公司）； T18 勻漿機(jī)（德國IKA 公司）； Dimension Xpand Plus西門子全自動生化分析儀（德國西門子公司）； Excelsior AS 自動組織脫水機(jī)、 GEMINI AS 全自動染色機(jī)、 HM340E轉(zhuǎn)輪式切片機(jī) （美國Thermo 公司）； KD-BM Ⅱ包埋機(jī)、KD-PI 電腦生物組織攤片機(jī)、 KD-H 烘片機(jī)（烤片機(jī)） （浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）； QCT-1800 病理取材臺（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）； Axio Lab. A1 顯微鏡（德國ZEISS 公司）； BM-30 生物顯微鏡（上海光學(xué)儀器六廠）； DGX-9073B 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海南榮實驗室設(shè)備有限公司）； SONY DSC-RX100 數(shù)碼照相機(jī)[索尼數(shù)字產(chǎn)品（無錫） 有限公司]。

1.3 動物 SPF 級SD 大鼠80 只, 雄性, 體質(zhì)量153.6 ～184.3 g, 由湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供； 實驗動物質(zhì)量合格證號43004700039669, 實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK （湘） 2016-0002。 大鼠接收后進(jìn)行檢疫及適應(yīng)性觀察, 每天1 次, 連續(xù)3～4 d, 包括一般精神狀態(tài)、 皮毛、活動情況等, 觀察無異常后開始實驗。

2 方法

2.1 高脂飼料、 乳劑制備 高脂飼料由10%豬油+10%蛋黃粉+1%膽固醇+5%蔗糖+0.2%膽鹽+73.8%基礎(chǔ)飼料組成,高脂乳劑由20 g 花生油+20 g 豬油+15 g 膽固醇+3 g 豬膽鹽+5 mL 吐溫-80+5 mL 丙二醇+蒸餾水適量, 定容至100 mL。造模開始1 ～4 周高脂乳劑灌胃, 劑量按2.5、 5、 7.5、10 mL/kg每周遞增, 造模第5、 6 周為10 mL/kg, 每天1 次。

2.2 給藥劑量配制 克癀膠囊給藥劑量配制方法見表1,水飛薊賓膠囊、 多烯磷脂酰膽堿膠囊給藥劑量分別為35 mg/kg、 0.14 g/kg （均為成人劑量的1 倍）。

表1 克癀膠囊給藥劑量配制方法

2.3 模型建立 80 只大鼠取10 只作為陰性對照組, 給予SPF 大鼠生長繁殖飼料加純化水灌胃； 其余70 只給予高脂飼料喂養(yǎng)6 周, 并且每天灌胃高脂乳劑1 次, 第1～4 周劑量按2.5、 5、 7.5、 10 mL/kg 每 周 遞 增, 第5 ～6 周 為10 mL/kg, 建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。 造模期間, 因灌胃操作失誤死亡10 只大鼠, 因體質(zhì)量不合格淘汰6 只造模大鼠, 其余造模成功大鼠按體質(zhì)量區(qū)間法隨機(jī)分為6 組,每組9 只, 分別為模型組、 水飛薊賓膠囊組、 多烯磷脂酰膽堿膠囊組及克癀膠囊高、 中、 低劑量組（1.51、 0.76、0.38 g/kg）。 另外, 陰性對照組大鼠因體質(zhì)量不合格淘汰1 只。

造模后, 陰性對照組、 模型組大鼠給予純化水, 其余各組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)藥物1 mL/100 g, 連續(xù)14 d,每天1 次, 給藥期間所有大鼠給予SPF 大鼠生長繁殖飼料和正常飲水。 各組給藥方案見表2。

表2 各組給藥方案（n=9）

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 體質(zhì)量、 一般狀況 實驗期間, 每天觀察大鼠狀態(tài)； 造模期間, 每周測量大鼠體質(zhì)量1 次； 給藥時, 每3 d測量大鼠體質(zhì)量1 次。

2.4.2 肝組織、 血清生化指標(biāo) 末次給藥后, 大鼠禁食不禁水16 h, 第2 天腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉, 腹主動脈取血 5 mL, 采血后靜置 30 min,3 000 r/min離心10 min, 收集血清, 檢測TCH、 TG、 HDL、LDL 水平。 再稱取肝組織0.2 g, 加入9 倍量乙醇-丙酮（1 ∶1） 制成100 g/L 肝勻漿, 3 000 r/min 離心10 min, 取上清液, 檢測TCH、 TG 水平。

2.4.3 肝指數(shù) 取大鼠肝臟, 稱定濕重, 計算肝指數(shù)=（肝臟濕重/體質(zhì)量） ×100%。

2.4.4 肝組織病理變化 切取大鼠肝右葉組織, 置于10%中性福爾馬林中固定, 常規(guī)石蠟包埋, 切片, HE 染色, 進(jìn)行病理分析。 檢查標(biāo)準(zhǔn)[7]見表3。

表3 大鼠肝組織病理變化檢查標(biāo)準(zhǔn)

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以） 表示, 多組間比較采用單因素方差分析； 組間均數(shù)兩兩比較時, 方差齊采用LSD 法, 方差不齊采用Dunnett’s T3 法, α=0.05 或0.01。 P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般狀況 大鼠毛發(fā)整潔光澤, 行動靈活, 飲食飲水正常, 排泄物正常, 未見異常。

3.2 大鼠肝指數(shù) 表4 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組大鼠肝指數(shù)顯著增加（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊中劑量組大鼠肝指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

表4 各組大鼠肝指數(shù)比較， n=9）

表4 各組大鼠肝指數(shù)比較， n=9）

注：與陰性對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2265_1194_2315.png陰性對照組 2.550±0.069模型組 3.312±0.160**克癀膠囊高劑量組 3.252±0.352克癀膠囊中劑量組 2.997±0.261▲▲克癀膠囊低劑量組 3.140±0.274水飛薊賓膠囊組 3.000±0.251▲▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 2.988±0.103▲▲

3.3 大鼠肝組織指標(biāo) 表5 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組TCH、 TG 水平顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較,克癀膠囊中劑量組TCH 水平顯著降低（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血脂指標(biāo)比較 n=9）

表5 各組大鼠血脂指標(biāo)比較 n=9）

注：與陰性對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,▲P＜0.05

images/BZ_220_1284_1849_2242_1899.png陰性對照組 1.140±0.137 0.817±0.143模型組 1.621±0.122** 1.103±0.127**克癀膠囊高劑量組 1.515±0.102 1.223±0.290克癀膠囊中劑量組 1.447±0.177▲ 1.041±0.222克癀膠囊低劑量組 1.539±0.099 1.087±0.188水飛薊賓膠囊組 1.568±0.078 1.168±0.181多烯磷脂酰膽堿膠囊組 1.498±0.183 1.090±0.182

3.4 大鼠血清指標(biāo) 表6 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組TCH、 LDL 水平顯著升高（P＜0.05, P＜0.01）, HDL 水平顯著降低（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊高、 中劑量組TCH 水平顯著降低（P＜0.01）, 各劑量組LDL 水平顯著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

表6 各組大鼠血清指標(biāo)比較（±s， n=9）

表6 各組大鼠血清指標(biāo)比較（±s， n=9）

注：與陰性對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較,▲P＜0.05,▲▲P＜0.01

images/BZ_220_236_2745_2244_2795.png陰性對照組 1.694±0.203 0.598±0.193 0.592±0.075 0.387±0.042模型組 2.048±0.322* 0.571±0.178 0.476±0.103** 0.554±0.093**克癀膠囊高劑量組 1.609±0.323▲▲ 0.745±0.271 0.447±0.075 0.422±0.094▲▲克癀膠囊中劑量組 1.603±0.091▲▲ 0.622±0.203 0.460±0.053 0.421±0.046▲▲克癀膠囊低劑量組 1.801±0.319 0.722±0.205 0.504±0.067 0.461±0.092▲水飛薊賓膠囊組 1.647±0.242▲▲ 0.668±0.165 0.476±0.047 0.436±0.086▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 1.776±0.267 0.606±0.100 0.469±0.058 0.497±0.092

3.5 大鼠肝組織病理變化 圖1 顯示, 陰性對照組大鼠肝細(xì)胞未見明顯脂肪變性（＜5%）； 模型組大鼠可見較明顯的肝細(xì)胞脂肪變性（＞50%）, 肝小葉內(nèi)點狀壞死、 少量炎細(xì)胞浸潤； 克癀膠囊組、 水飛薊賓膠囊組、 多烯磷脂酰膽堿膠囊組組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性程度較模型組有不同程度減輕, 小葉內(nèi)可見點狀壞死灶。 分級匯總見表7。

圖1 各組大鼠肝組織病理變化（HE， ×100）

表7 大鼠肝組織病理變化分級匯總（n=9）

表8 顯示, 與陰性對照組比較, 模型組大鼠肝臟病理學(xué)診斷評分顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較, 克癀膠囊中劑量組評分顯著降低（P＜0.05）。

表8 大鼠肝臟病理學(xué)診斷評分s， n=9）

表8 大鼠肝臟病理學(xué)診斷評分s， n=9）

注：與陰性對照組比較,** P ＜0.01；與模型組比較,▲P ＜0.05,▲▲P＜0.01

陰性對照組 0.22±0.44模型組 4.44±0.73**克癀膠囊高劑量組 3.89±1.27克癀膠囊中劑量組 3.33±1.00▲克癀膠囊低劑量組 3.44±1.01水飛薊賓膠囊組 2.33±1.50▲▲多烯磷脂酰膽堿膠囊組 3.56±1.24

4 討論

本實驗設(shè)計了克癀膠囊低、 中、 高3 個劑量組, 分別相當(dāng)于成人臨床等效劑量的0.5、 1、 2 倍, 發(fā)現(xiàn)1 倍劑量時療效最佳； 2 倍劑量療效低于1 倍劑量, 但優(yōu)于0.5 倍劑量, 可能與給藥濃度過高有關(guān), 導(dǎo)致藥物未經(jīng)大鼠胃腸道充分吸收即排出體外, 不能充分發(fā)揮作用。 劑量對療效發(fā)揮有著重要影響, 本實驗發(fā)現(xiàn)克癀膠囊治療非酒精性脂肪肝時存在最佳服用劑量, 超過一定劑量后療效與其不呈正比關(guān)系, 這對進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥, 把握其最佳治療窗閾具有重要指導(dǎo)意義。 同時, 最佳劑量給藥方案經(jīng)濟(jì)成本效益最高, 有利于減少醫(yī)療資源浪費, 為臨床合理用藥提供依據(jù)。

中醫(yī)將非酒精性脂肪肝歸于“肝癖” “脅痛” “積聚”“痰證” “瘀證” 等范疇, 認(rèn)為痰、 濕、 濁、 瘀、 熱為其主要病理因素[8]。 克癀膠囊藥性和緩不傷正, 是治療濕熱毒邪內(nèi)蘊(yùn)、 瘀血阻絡(luò)證、 急慢性肝炎等疾病的傳統(tǒng)中藥, 方中三七活血化瘀, 消腫定痛, 具有降血脂、 降血糖、 清除自由基、 抗炎、 抗氧化[9]等藥理作用, 其活性成分三七皂苷有著改善血液循環(huán)、 增加機(jī)體免疫力、 抗炎、 抗衰老、護(hù)肝等多種生理活性[10-11], 可提高肝組織及血清超氧化物歧化酶（SOD） 水平, 減少肝糖原消耗, 改善肝微循環(huán),減輕線粒體、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器損傷及肝纖維化[12]； 黃連具有抑制肝臟細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成等作用, 可減少肝臟對脂質(zhì)的儲存[13-14]； 黃芩具有降低血脂、 肝脂質(zhì)水平、 增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力[15]； 紅曲是以大米為原料, 經(jīng)紅曲霉發(fā)酵而成的一種紫紅色米曲, 其所含洛伐他汀可抑制體內(nèi)膽固醇合成, 具有顯著的降血脂功能[16], 各組分具有保肝降脂的協(xié)同作用, 可能是中藥復(fù)方多成分、 多靶點協(xié)同增效的機(jī)理。目前臨床治療非酒精性脂肪肝的藥物, 如貝特、 他汀類等在降脂的同時存在一定肝毒性[17], 這與臨床上保肝降脂的目的存在矛盾, 故克癀膠囊這一傳統(tǒng)保肝降脂中藥顯示了優(yōu)勢。

綜上所述, 克癀膠囊能顯著降低非酒精性脂肪肝大鼠血清TC、 LDL 水平, 明顯緩解肝細(xì)胞脂肪變性, 減輕肝臟質(zhì)量, 降低肝指數(shù), 保護(hù)肝功能, 表現(xiàn)出良好的防治作用,可為該制劑臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。