賈 萍， 陳 剛

（1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 重慶400016； 2. 重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院制藥工程系， 重慶400067）

尿酸鹽晶體激發(fā)的炎癥是痛風(fēng)核心病理特征[1], 它一旦在關(guān)節(jié)組織中形成, 則可通過(guò)與巨噬細(xì)胞、 中性粒細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞等細(xì)胞表面的Toll 樣受體（TLR） -2、 4 結(jié)合[2], 經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而激活NF-κB 抑制蛋白（IκB） 激酶（IKK） 使IκBα 降解, NF-κB 二聚體（主要是p65/p50） 游離后核移位, 與靶基因啟動(dòng)子上κB 序列特異性結(jié)合, 啟動(dòng)細(xì)胞因子、 粘附分子、 趨化因子等眾多炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄[3]。 因此, 調(diào)控NF-κB 活化被公認(rèn)為是治療痛風(fēng)的有效手段之一。

盡管現(xiàn)有抗痛風(fēng)藥物療效確切, 但不良反應(yīng)明顯, 因此從中醫(yī)藥中探尋有效、 不良反應(yīng)小的方劑有重要意義[4]。 豨桐丸來(lái)源于《濟(jì)世養(yǎng)生集》 卷三, 具有祛風(fēng)勝濕、 舒筋活絡(luò)之功效, 是中醫(yī)治療痹癥（痛風(fēng)屬于中醫(yī)“痹癥” 范疇） 的經(jīng)典常用方劑, 課題組前期發(fā)現(xiàn)它可抑制尿酸鹽誘導(dǎo)大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)展, 降低關(guān)節(jié)組織中白細(xì)胞介素-1β （IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 的表達(dá)[5]； 可抑制尿酸鹽誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Nod 樣受體蛋白3（NLRP3） 炎性體活化, 以及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β 成熟體；還可抑制尿酸鹽誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1β 前體, 但其機(jī)制迄今仍不清楚。 因此, 本實(shí)驗(yàn)選擇尿酸鹽誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞株, 觀察豨桐丸對(duì)IL-1β 表達(dá)、 IκBα降解、 p65 蛋白核轉(zhuǎn)移、 NF-κB 與DNA 結(jié)合活性的影響,以期闡明該制劑拮抗痛風(fēng)炎癥發(fā)展的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試藥 豨薟草、 臭梧桐葉均購(gòu)自重慶桐君閣股份有限公司, 經(jīng)西南大學(xué)藥學(xué)院張繼芬副教授鑒定為正品。 IL-1β酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R＆D 公司, 批號(hào)673827）； 金絲桃苷、 奇壬醇對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司, 批號(hào)201018、 201153）； 秋水仙堿（美國(guó)Sigma 公司,批號(hào)1002048038）； ECL 試劑（美國(guó)Milipore 公司, 批號(hào)1331501）； p65、 IκBα、 β-actin、 Lamin B1 抗 體 （美 國(guó)Santa Cruz 公 司, 批 號(hào)B2125、 F2014、 C2011、 B2255）；RIPA 裂解液 （上海碧云天生物科技有限公司, 批號(hào)110317180212）； p65 與DNA 結(jié)合活性檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Active Motif 公司, 批號(hào)521478932）。

1.3 儀器 Infinite M200 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；ChemiDoc XRS 型成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）； RC24 型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）； Mill-iQ 型純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中（含100 U/mL 青霉素、 100 μg/mL 鏈霉素）, 37 ℃、 5%CO2下培養(yǎng)。

2.2 豨桐丸制備 取豨薟草、 臭梧桐葉各500 g, 置于10倍體積蒸餾水中浸泡1 h 后煮沸提取1 h, 重復(fù)3 次, 合并提取液, 經(jīng)過(guò)濾、 濃縮并真空冷凍干燥后得到固體提取物,密封保存于-20 ℃下。 臨用前, 用DMEM 培養(yǎng)基配制成4 mg/mL母液, 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌后備用。

2.3 尿酸鹽晶體制備[6]4 g 尿酸溶于800 mL 雙蒸水中,加熱溶液至60 ℃后用0.5 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至8.9, 4 ℃冰箱中過(guò)夜, 4 000 r/min 離心20 min, 收集沉淀, 即得, 高壓滅菌、 烘干。 臨用前, 在無(wú)菌條件下用DMEM 培養(yǎng)基配制成2 mg/mL 母液備用。

2.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用MTT 法。 RAW264.7 細(xì)胞以1×104/孔的密度培養(yǎng)于96 孔板中, 24 h 后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、 實(shí)驗(yàn)組（25、 50、 100、 200、 400、 800 μg/mL）,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。 加入MTT 至終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 棄培養(yǎng)液, 每孔加入200 μL DMSO, 于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度, 計(jì)算細(xì)胞活力, 公式為細(xì)胞活力=（實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度） ×100%。

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。RAW264.7 細(xì)胞以1×105/孔的密度培養(yǎng)于96 孔板中, 24 h后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、 模型組（200 μg/mL）、 秋水仙堿組（陽(yáng)性對(duì)照, 0.4 μg/mL 秋水仙堿+200 μg/mL 尿酸鹽, 臨用前用DMSO 溶解成200 mg/mL 母液, 最終培養(yǎng)體系中DMSO 終濃度為0.1%） 及豨桐丸低、 中、 高劑量組（100、 200、 400 μg/mL 豨桐丸+200 μg/mL 尿酸鹽）。 上述藥物預(yù)作用2 h 后, 加入尿酸鹽繼續(xù)培養(yǎng)18 h, 取細(xì)胞培養(yǎng)液, 12 000 r/min 離心5 min, 按照ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-1β 水平。

2.6 細(xì)胞總蛋白、 核蛋白提取制備 RAW264.7 細(xì)胞以1×105/孔的密度培養(yǎng)于96 孔板中, 24 h 后將細(xì)胞分為對(duì)照組、 模型組（200 μg/mL）、 秋水仙堿組 （陽(yáng)性對(duì)照藥,0.4 μg/mL 秋水仙堿+200 μg/mL 尿酸鹽） 及豨桐丸低、中、 高劑量組（100、 200、 400 μg/mL 豨桐丸+200 μg/mL尿酸鹽）。 上述藥物預(yù)作用2 h 后, 加入尿酸鹽刺激30 min（用于IκBα 檢測(cè)） 或2 h （用于p65、 NF-κB 與DNA 的結(jié)合活性檢測(cè)）。 收集細(xì)胞, 冰預(yù)冷PBS 緩沖液（pH=7.4）洗滌3 次后, 按照文獻(xiàn)[7] 方法提取總蛋白（用于IκBα檢測(cè)） 或核蛋白（用于p65、 NF-κB 與DNA 的結(jié)合活性檢測(cè)）, 于-70 ℃下保存?zhèn)溆谩?然后, BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。

2.7 細(xì)胞中IκBα 表達(dá)及胞核中p65 表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。 取細(xì)胞總蛋白或核蛋白提取物, SDSPAGE 電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF 膜, 5%脫脂奶粉于室溫下封閉1 h, 然后分別與IκBα、 p65、 β-actin、 Lamin B1 抗體在4 ℃下共同孵育過(guò)夜, 再與相應(yīng)的Ⅱ抗于室溫下共同孵育1 h, 加入ELC 試劑顯影、 檢測(cè)。

2.8 p65 與DNA 結(jié)合活性檢測(cè) 取提取的胞核蛋白, 按照Trans AMTMNF-κB p65 活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以） 表示, 組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 提取物制備 1 000 g 豨桐丸共得到固體提取物208 g,提取率20.8%。 HPLC 法測(cè)得奇壬醇、 金絲桃苷含有量分別為1.36、 0.22 mg/g。

3.2 豨桐丸對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力的影響 25 ～

400 μg/mL豨桐丸細(xì)胞活力與對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）, 故本實(shí)驗(yàn)確定劑量100、 200、 400 μg/mL。

3.3 豨桐丸對(duì)IL-1β 水平、 p65 與DNA 結(jié)合活性的影響表1 顯示, 與對(duì)照組比較, 模型組IL-1β 水平、 p65 與DNA 結(jié)合活性顯著升高（P＜0.01）； 與模型組比較, 豨桐丸（200、 400 μg/mL） 組兩者顯著降低 （P ＜0.05, P ＜0.01）。

表1 豨桐丸對(duì)IL-1β 表達(dá)、 p65 與DNA 結(jié)合活性的影響s， n=3）

表1 豨桐丸對(duì)IL-1β 表達(dá)、 p65 與DNA 結(jié)合活性的影響s， n=3）

注： 與對(duì)照組比較, **P ＜0.01；與模型組比較,＃P ＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 劑量/（μg·mL-1）IL-1β/（pg·mL-1）p65 與DNA結(jié)合活性對(duì)照組 — 12.4±1.1 0.16±0.04模型組 200 29.9±3.1** 1.2±0.18**秋水仙堿組 0.4 17.1±1.5＃＃ 0.36±0.11＃＃豨桐丸低劑量組 100 27.9±0.9 1.13±0.17豨桐丸中劑量組 200 23.9±1.7＃ 0.86±0.09＃豨桐丸高劑量組 400 19.9±1.6＃＃ 0.66±0.05＃＃

3.4 豨桐丸對(duì)IκBα、 p65 表達(dá)的影響 表2、 圖1 顯示,與對(duì)照組比較, 模型組IκBα 表達(dá)顯著降低（P ＜0.01）,p65 表達(dá)顯著升高（P ＜0.01）； 與模型組比較, 豨桐丸（200、 400 μg/mL） 組前者表達(dá)顯著升高（P＜0.01）, 后者表達(dá)顯著降低（P＜0.05, P＜0.01）。

表2 豨桐丸對(duì)IκB、 p65 表達(dá)的影響， n=3）

表2 豨桐丸對(duì)IκB、 p65 表達(dá)的影響， n=3）

注：與對(duì)照組比較, **P ＜0.01；與模型組比較,＃ P ＜0.05,＃＃P＜0.01

組別 劑量/（μg·mL-1）IκBα/β-actin p65/Lamin B1對(duì)照組 — 0.14±0.02 0.51±0.12模型組 200 0.01±0.002** 2.98±0.19**秋水仙堿組 0.4 0.11±0.02＃＃ 0.81±0.1＃＃豨桐丸低劑量組 100 0.01±0.003 3.04±0.14豨桐丸中劑量組 200 0.06±0.02＃＃ 2.41±0.11＃豨桐丸高劑量組 400 0.09±0.03＃＃ 1.21±0.18＃＃

4 討論

大量研究證實(shí)了IL-1β 在痛風(fēng)炎癥過(guò)程中的關(guān)鍵作用[8], 它可促進(jìn)中性粒細(xì)胞向尿酸鹽沉積的部位遷移, 從而誘導(dǎo)痛風(fēng)急性發(fā)作； 也可激活多種炎性細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB, 誘導(dǎo)大量炎性介質(zhì)基因, 如細(xì)胞因子、 黏附分子、 趨化因子等的轉(zhuǎn)錄； 還與關(guān)節(jié)局部破骨細(xì)胞活化、 神經(jīng)元介導(dǎo)機(jī)體對(duì)炎性疼痛的過(guò)度敏感等病理變化密切相關(guān)[9]。 臨床試驗(yàn)也表明, IL-1β 拮抗劑, 如rilonacept[10]、anakinra[11]和canakinumab[12]均表現(xiàn)出良好的抗痛風(fēng)療效,故拮抗IL-1β 產(chǎn)生或功能被認(rèn)為是治療痛風(fēng)的有效手段。

圖1 各組IκB、 p65 表達(dá)

尿酸鹽誘導(dǎo)IL-1β 產(chǎn)生的分子機(jī)制已被基本闡述清楚[13], 關(guān)節(jié)局部沉積的尿酸鹽可被滑膜成纖維細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞等識(shí)別而被吞噬, 該病理過(guò)程主要由TLR2/TLR4-MyD88 信號(hào)分子介導(dǎo)[14]。 當(dāng)尿酸鹽刺激信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)后, 一方面可激活I(lǐng)KK, 使IκB 發(fā)生泛素化降解, 進(jìn)而使p65 蛋白游離并進(jìn)入細(xì)胞核, 最終誘導(dǎo)大量炎性介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄, 如細(xì)胞因子、 黏附分子、 趨化因子等[3]； 另一方面,它可活化NLRP3 炎性體, 激活caspase-1, 后者將無(wú)活性的pro-IL-1β （31 kD） 剪切成有活性 的IL-1β 成熟體 （17 kD）[15]； IL-1β 被分泌到細(xì)胞外后, 可與眾多炎性細(xì)胞表面的IL-1R 結(jié)合, 導(dǎo)致NF-κB 激活, 最終誘導(dǎo)與放大尿酸鹽激發(fā)的炎癥信號(hào)。

本實(shí)驗(yàn)表明, 尿酸鹽刺激后巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中有大量IL-1β, 提示它誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞IL-1β 基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)； 預(yù)先給予豨桐丸處理后, 其培養(yǎng)液中IL-1β 水平明顯減少, 提示該制劑顯著抑制了尿酸鹽誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中IL-1β 基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 尿酸鹽刺激可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中IκB表達(dá)明顯減少, 表明尿酸鹽誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞中其蛋白泛素化降解。 靜息狀態(tài)下, IκB 與NF-κB （p65/p50 二聚體） 相結(jié)合, 抑制了后者活化, 一旦IκB 降解, 則使p65 發(fā)生核轉(zhuǎn)移而啟動(dòng)促炎基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)先給予豨桐丸處理后再用尿酸鹽刺激時(shí), RAW264.7 細(xì)胞核中p65表達(dá)及p65 與DNA 結(jié)合活性均明顯降低, 表明該制劑可抑制了尿酸鹽誘導(dǎo)的p65 核轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)錄活性。

綜上所述, 豨桐丸可降低尿酸鹽刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-1β, 其機(jī)制可能與抑制NF-κB 活化密切相關(guān), 以期為該制劑臨床治療痛風(fēng)提供參考, 為研發(fā)相關(guān)新藥提供依據(jù)。