毛 艷， 蔡曉翠， 龐克堅(jiān)， 賀金華*， 何 江

（1. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所， 新疆 烏魯木齊830004； 2. 和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司， 新疆 和田848200）

健心合米爾高滋斑安比熱片由牛舌草、 牛舌草花、 珍珠、 琥珀、 紅寶石、 檀香、 玫瑰花等14 味藥材組成, 具有補(bǔ)益支配器官的功效, 用于治療心悸、 失眠多夢(mèng), 但原標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀、 理化鑒別項(xiàng)[1], 并無(wú)定性鑒別、 含有量測(cè)定,故國(guó)家藥典委員會(huì)將其列入2015 年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作（中藥） 中。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)健心合米爾高滋斑安比熱片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行改進(jìn), 以期更有效地控制該制劑質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀, 配置二極管陣列檢測(cè)器、 四元梯度泵、 在線脫氣機(jī)、 自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、 4～40 ℃恒溫箱（美國(guó)Thermo Scientific Technologies公司）； CPA225D 電子天平（0.01 mg, 德國(guó)Sartorius 公司）； AS20500BDT 超聲波清洗器（40 kHz、 240 W, 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）； UPT-Ⅱ-10T 優(yōu)普特實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）； SP-20E 全自動(dòng)點(diǎn)樣儀（上?？普苌萍加邢薰荆?； WFH-201B 紫外投射反射儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）； CX31RTSF 顯微鏡, 配置ScopePhoto 3.0 成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）。

1.2 試藥 迷迭香酸 （批號(hào)111871-201505, 含有量98.5%）、 檀香油（批號(hào)110789-200005）、 甘氨酸（批號(hào)110735-200102）、 丙氨酸 （批號(hào)140680-201303, 含有量99.9%）、 木犀草素（批號(hào)111520-200504）、 齊墩果酸（批號(hào)110709-200505）、 芳樟醇（批號(hào)111503-201302, 含有量98.5%）、 香葉醇（批號(hào)111643-200301） 對(duì)照品及玫瑰花（批號(hào)121508-201403）、 檀香（批號(hào)121240-201002） 對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。 健心合米爾高滋斑安 比 熱 片 （ 批 號(hào) 20140602、 20150301、 20150302、20150501、 20150502、 20150901、 20151001、 20151002、20151201、 20151202） 和方中藥材（由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員鑒定為正品） 均由和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司提供。 薄層層析用硅膠G、 硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。 乙腈為色譜純； 其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 定性鑒別

2.1.1 珍珠、 琥珀、 紅寶石[2-3]本品粉末呈棕黃色, 取適量置于載玻片中央, 加水合氯醛試液1 滴, 解剖針攪勻并使其浸潤(rùn)粉末, 酒精燈上加熱至微沸后離火, 再加水合氯醛試液1 滴, 解剖針攪勻, 再加熱, 如此反復(fù)3 次, 離火, 加稀甘油1～2 滴, 攪勻, 蓋片。 顯微鏡下發(fā)現(xiàn), 珍珠為不規(guī)則形碎塊, 半透明, 呈淡黃棕色, 邊緣色較暗, 有光澤, 表面顯顆粒性, 由數(shù)個(gè)至十?dāng)?shù)個(gè)薄層重疊, 片層結(jié)構(gòu)排列緊密, 可見(jiàn)致密的成層線條或微波狀紋理, 有的表面有裂紋, 小塊片亦由多數(shù)薄片重疊[4], 見(jiàn)圖1； 琥珀為不規(guī)則形結(jié)晶塊, 透明或半透明, 呈淡黃色或紅棕色, 大多為一邊厚、 一邊薄的斜塊片, 富有立體感, 加熱不熔化[5]； 紅寶石為不規(guī)則形碎塊, 透明或半透明, 呈灰白色,具明顯放射狀、 弧形或近平行的細(xì)紋理, 邊緣色較暗, 棱角銳尖, 有光澤。

2.1.2 玫瑰花 取本品10 片, 除去糖衣, 研細(xì), 取約3 g, 加25 mL 乙醇超聲（59 kHz、 160 W） 20 min, 濾過(guò),濾液蒸干, 殘?jiān)? mL 乙醇溶解, 作為供試品溶液； 另取對(duì)照藥材1.0 g, 研細(xì), 同法制成相應(yīng)溶液。 按照2015 年版《中國(guó)藥典》 薄層色譜法（通則0502）, 吸取上述溶液各3 μL, 點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上, 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶5 ∶1） 預(yù)飽和15 min 后展開(kāi), 取出, 晾干, 噴以1%三氯化鐵乙醇溶液, 顯色后日光下檢視, 結(jié)果見(jiàn)圖2。 由圖可知, 供試品色譜在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn), 陰性無(wú)干擾[6-9]。

圖1 珍珠、 琥珀、 紅寶石顯微圖

圖2 玫瑰花TLC 色譜圖

2.1.3 檀香 取本品10 片, 除去糖衣, 研細(xì), 取約3 g,加25 mL 石油醚超聲處理（59 kHz、 160 W） 20 min, 濾過(guò), 濾液蒸干, 殘?jiān)? mL 石油醚溶解, 作為供試品溶液； 另取對(duì)照藥材0.5 g, 同法制成相應(yīng)溶液。 按照2015年版《中國(guó)藥典》 薄層色譜法（通則0502）, 吸取上述溶液各10 μL, 點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上, 石油醚-乙酸乙酯（17 ∶3） 預(yù)飽和薄層板30 min 后展開(kāi), 取出, 晾干, 置紫外光燈（365 nm） 下檢視, 結(jié)果見(jiàn)圖3。 由圖可知, 供試品色譜在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn), 陰性無(wú)干擾[8-9]。

圖3 檀香TLC 色譜圖

2.1.4 香青蘭、 蠶繭、 龍涎香、 牛舌草 香青蘭主要含有揮發(fā)油、 黃酮類、 氨基酸, 本實(shí)驗(yàn)以含有量較高的齊墩果酸、 木犀草素為對(duì)照進(jìn)行TLC 鑒別, 發(fā)現(xiàn)兩者陰性均有干擾, 見(jiàn)圖4。 蠶繭主要成分為氨基酸, 本實(shí)驗(yàn)以含有量最高的甘氨酸、 丙氨酸為對(duì)照進(jìn)行TLC 鑒別, 發(fā)現(xiàn)兩者陰性均有干擾, 見(jiàn)圖5。 龍涎香主要含有甾醇、 揮發(fā)性成分,本實(shí)驗(yàn)以含有量較高的芳樟醇、 香葉醇為對(duì)照進(jìn)行TLC 鑒別, 發(fā)現(xiàn)兩者陰性均有干擾, 見(jiàn)圖6。 牛舌草主要含有皂苷、 黃酮、 氨基酸、 揮發(fā)油等成分, 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行TLC 鑒別時(shí)發(fā)現(xiàn)它們陰性均有干擾[10-11], 見(jiàn)圖7。

圖4 香青蘭TLC 色譜圖

圖5 蠶繭TLC 色譜圖

圖6 龍涎香TLC 色譜圖

2.2 迷迭香酸含有量測(cè)定

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取迷迭香酸對(duì)照品6.57 mg,置于25 mL 量瓶中, 流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度, 搖勻, 制成每1 mL 含0.258 9 mg 該成分的溶液, 即得。

圖7 牛舌草TLC 色譜圖

2.2.1.2 供試品溶液 取本品20 片, 除去糖衣, 研細(xì),精密稱取約0.3 g, 置于具塞錐形瓶中, 加20 mL 流動(dòng)相,稱定質(zhì)量, 超聲（250 W、 40 kHz） 45 min, 放冷, 流動(dòng)相補(bǔ)足減失的質(zhì)量, 搖勻, 上清液濾過(guò), 取續(xù)濾液, 即得。

2.2.2 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠； 流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸（18 ∶82）； 檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm； 體積流量1 mL/min； 柱溫30 ℃。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按處方比例稱取缺牛舌草、 缺香青蘭、 缺牛舌草花及缺牛舌草、 香青蘭、 牛舌草花的藥材,按照與制備工藝相同的方法制得陰性樣品溶液, 同時(shí)制備對(duì)照品、 供試品溶液, 在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 結(jié)果見(jiàn)圖8, 可知陰性無(wú)干擾, 方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、 0.6、 0.8、 1.0、 1.4、 1.8 mL 至10 mL 量瓶中,流動(dòng)相定容至刻度, 搖勻, 分別精密吸取10 μL, 在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 得方程為Y=366.73X+0.139 8 （r=0.999 2）, 在0.005 18 ～0.046 59 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次, 測(cè)得迷迭香酸峰面積RSD 為0.26%, 表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)20150301）, 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液, 在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得迷迭香酸含有量RSD 為0.61%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（批號(hào)20150301） 溶液, 10 ℃下于0、 2.5、 5、 7.5、 12.5、 24 h 在“2.2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得迷迭香酸峰面積RSD 為1.37%, 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 中間精密度試驗(yàn) 取同一供試品 （批號(hào)20150301）, 在不同日期經(jīng)不同人員按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備2 份供試品溶液, 在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5 次, 測(cè)得迷迭香酸含有量RSD 為1.42%, 表明該方法中間精密度良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的供試品（批號(hào)20150301） 約0.15 g, 共6 份, 置于具塞錐形瓶中,精密加入對(duì)照品溶液1 mL, 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算回收率, 結(jié)果見(jiàn)表1。

圖8 迷迭香酸HPLC 色譜圖

表1 迷迭香酸加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.2.10 樣品含有量測(cè)定 取本品適量, 按“2.2.1.2” 項(xiàng)下方法制備10 批供試品溶液, 在“2.2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算迷迭香酸含有量, 結(jié)果分別為0.88、 0.89、0.89、 0.95、 0.96、 0.87、 0.87、 0.91、 0.98、 0.89 mg/片。由于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中藥材來(lái)源不同, 迷迭香酸含有量也會(huì)有所變化, 故在此基礎(chǔ)上再下調(diào)20%, 即本品含有量以該成分計(jì), 每片不得少于0.73 mg。

3 討論

3.1 檀香TLC 定性鑒別 課題組前期曾參照2015 年版《中國(guó)藥典》 一部方法[3], 提取藥材中揮發(fā)油后進(jìn)行點(diǎn)樣,但該方法費(fèi)時(shí)繁瑣, 樣品耗費(fèi)量大。 本實(shí)驗(yàn)采用石油醚超聲處理樣品, 該方法簡(jiǎn)便快速, 斑點(diǎn)清晰, 陰性無(wú)干擾。

3.2 玫瑰花TLC 定性鑒別 玫瑰花中主要含有揮發(fā)油、黃酮、 鞣質(zhì), 故本實(shí)驗(yàn)分別采用乙醇、 50% 乙醇、 乙酸乙酯處理樣品, 展開(kāi)劑選擇石油醚-乙酸乙酯（9 ∶1）、 甲醇-冰醋酸-水（8 ∶1 ∶3）、 甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7 ∶2 ∶1）等, 發(fā)現(xiàn)只有鞣質(zhì)陰性無(wú)干擾, 可列入TLC 定性鑒別。

3.3 含有量測(cè)定 課題組前期考察了寶心艾維西木口服液, 發(fā)現(xiàn)其組方和功效與健心合米爾高滋斑安比熱片極為相似, 均含有牛舌草、 香青蘭、 檀香等藥材, 并通過(guò)HPLC-MS 法初步推測(cè)其化學(xué)成分, 確定牛舌草、 香青蘭中含有迷迭香酸。 迷迭香酸是存在于迷迭香中的水溶性多酚類成分, 具有抗氧化、 抗炎、 抗病毒、 抗血栓、 抗血小板聚集、 抗抑郁等多種生物活性, 與健心合米爾高滋斑安比熱片主要功效一致, 而且含有量較高, 故以其為指標(biāo)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 牛舌草花、 牛舌草、 香青蘭中都含有迷迭香酸,含有量分別為0.671%、 0.208%、 0.092%, 可為相關(guān)定量測(cè)定提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

健心合米爾高滋斑安比熱片方中藥材大多為新疆地產(chǎn),具有較好的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。 但《維吾爾藥分冊(cè)》 中所收載藥材及制劑標(biāo)準(zhǔn)的研究水平整體上較低, 大多僅為藥材基原鑒定或理化鑒別, 并未建立完善的質(zhì)量控制體系, 導(dǎo)致長(zhǎng)期以來(lái)藥材品質(zhì)不一致, 以次充好現(xiàn)象嚴(yán)重, 臨床療效不穩(wěn)定, 制約了新疆地產(chǎn)中藥、 民族藥臨床應(yīng)用和市場(chǎng)開(kāi)拓。 本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了健心合米爾高滋斑安比熱片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確, 重復(fù)性好, 可為該制劑臨床安全有效的應(yīng)用提供理論依據(jù)。