羅 婷， 王佳琪， 江宇勤， 張 希， 張軍銀， 余凌英

（成都中醫(yī)藥大學(xué)， 四川 成都611137）

生姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rose 的新鮮根莖[1], 其味辛, 性溫, 歸肺、 脾二經(jīng), 功效發(fā)汗解表、 溫肺止咳、 溫中止嘔、 利水消痰、 散寒除濕, 炮制品主要有干姜、 煨姜、 姜炭等, 其中煨姜解表作用減弱, 部分揮發(fā)性、 刺激性成分減少, 使得藥性緩和, 主要用于溫中止嘔、腹痛泄瀉[2-4], 但目前對(duì)其報(bào)道較少, 缺乏規(guī)范化工藝研究。 因此, 本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化生姜紙煨工藝[5-6], 為該炮制品規(guī)范生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料

6-姜辣素對(duì)照品（內(nèi)標(biāo), CHB-J-024, 批號(hào)CHB160901）購自四川克洛瑪生物科技有限公司, 含有量98%以上。 生姜購于成都市溫江區(qū)永康超市, 經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為姜科植物姜Zingiber officinale Rose. 的新鮮根莖。 HPLC 色譜儀, 配置DAD 檢測(cè)器（日本島津公司）；BS110S 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）； KQ-300E 超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。 粗草紙購于成都市溫江區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測(cè)定（一測(cè)多評(píng)法）

2.1.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.1% 甲酸, 梯度洗脫（0 ～10 min, 45%乙腈； 10～15 min, 45% ～48%乙腈； 15～17 min,48% ～60% 乙 腈； 17 ～43 min, 60% 乙 腈； 43 ～45 min,60%～67%乙腈； 45 ～48 min, 67% ～69% 乙腈）； 體積流量0.5 mL/min； 檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm； 柱溫25 ℃； 進(jìn)樣量15 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取6-姜辣素對(duì)照品適量,置于25 mL 量瓶中, 甲醇溶解并定容至刻度, 即得（0.050 4 mg/mL）。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.1.3 供試品溶液制備 將炮制品切成1～2 mm 小塊, 精密稱取約1 g, 置于l00 mL 圓底燒瓶中, 精密加入50 mL甲醇, 密塞, 稱定質(zhì)量, 加熱回流30 min, 取出, 放冷后甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 0.45 μm 微孔濾膜過濾, 即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液, 甲醇 稀 釋 成 0.010 08、 0.020 16、 0.040 32、 0.060 48、0.080 64、 0.100 8 mg/mL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸, 得方程Y=2×107X-13 172 （r=0.999 1）, 在0.010 08～0.100 8 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液15 μL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次, 測(cè)得6-姜辣素峰面積RSD 為0.38%, 表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液15 μL, 于0、 2、4、 6、 12、 24 h 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得6-姜辣素峰面積RSD 為1.10%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批炮制品6 份, 每份1 g, 按“2.1.3” 項(xiàng)方法制備供試品溶液, 取15 μL, 在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得6-姜辣素含有量RSD 為1.92%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6-姜辣素含有量已知的同一批炮制品6 份, 精密加入適量6-姜辣素對(duì)照品, 按“2.1.3” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液, 取15 μL, 在“2.1.1” 色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 測(cè)得6-姜辣素平均回收率為96.52%, RSD 為2.31%。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 因素水平 以粗草紙層數(shù)（A）、 煨制溫度（B）、煨制時(shí)間（C） 為影響因素, 6-姜辣素、 8-姜酚、 10-姜酚含有量為評(píng)價(jià)指標(biāo), 每個(gè)因素3 個(gè)水平, 采用L9（34） 正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)[7-10]。 因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.2.2 炮制品制備 取大小均一的生姜9 份, 每份150 g,浸濕的粗草紙包裹。 取5 倍量細(xì)沙（過3、 6 號(hào)篩） 置于不銹鋼鍋中, 預(yù)熱, 將包裹好的生姜放進(jìn)鍋中, 細(xì)沙均勻蓋住, 測(cè)定中間位置溫度至實(shí)驗(yàn)要求后取出, 即得。

2.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算含有量。 根據(jù)2015 年版《中國(guó)藥典》 要求, 將6-姜辣素含有量權(quán)重系數(shù)確定為0.5, 8-姜酚、 10-姜酚含有量均為0.25, 計(jì)算綜合評(píng)分[11], 公式為綜合評(píng)分= （6-姜辣素含有量×0.5/最大值+8-姜酚含有量×0.25/最大值+10-姜酚含有量×0.25/最大值） ×100, 結(jié)果見表2, 方差分析見表3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由表2 可知, 各因素影響程度依次為B＞C＞A； 由表3可知, 因素A、 C 影不顯著 （P ＞0.05）, B 有顯著影響（P＜0.05）, 最優(yōu)工藝為A2B1C2, 即粗草紙3 層, 煨制溫度120 ℃, 煨制時(shí)間120 min。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法 表2 顯示, 粗草紙層數(shù)（A） 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最小, 故未對(duì)其作繼續(xù)考察, 固定為3 層,采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化煨制溫度、 煨制時(shí)間。

2.3.1 因素水平 以煨制溫度（X1）、 煨制時(shí)間（X2） 為影響因素, 每個(gè)因素5 個(gè)水平, 因素水平見表4。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法因素水平

2.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用“歸一化” 法, 每個(gè)指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1 間的“歸一值”, 計(jì)算幾何平均數(shù), 得總評(píng)“歸一值” （OD）, 公式為OD= （d1d2…dn）1/n, 其中n 為指標(biāo)數(shù)。 再采用Hassan 法分別計(jì)算dmin、 dmax, 公式分別為dmin= （ymax-yi） / （ymax-ymin）、 dmax= （yi-ymin） / （ymaxymin）[12]。 結(jié)果見表5。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3.3 模型擬合 將表6 數(shù)據(jù)導(dǎo)入Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸擬合, 得方程OD=-22.550 25+0.178 12X1+0.233 12X2+ 1.925 58× 10-4X1X2- 9.445 68× 10-4X12 -1.049 75×10-3X22 （R2=0.932 4）, 方差分析見表6。 由表可知, 模型具有顯著影響（P ＜0.05）, 而失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）, 表明模型擬合度良好； 因素X1、 X2均有顯著影響（P＜0.05）, 程度依次為X1＞X2。

表6 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法方差分析

2.3.4 響應(yīng)面分析 通過Design-Expert 8.0.6 軟件繪制響應(yīng)面圖, 見圖2。 結(jié)合正交試驗(yàn)結(jié)果, 得到最優(yōu)工藝為生姜150 g, 粗草紙3 層, 煨制溫度113.1 ℃, 煨制時(shí)間125.25 min。

2.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn), 結(jié)果見表7, 可知該工藝穩(wěn)定可靠, 符合實(shí)際要求。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

圖2 各因素響應(yīng)面圖

3 討論

正交試驗(yàn)?zāi)軐⒃囼?yàn)次數(shù)降到最低, 又能提供較多的試驗(yàn)信息, 但它采用線性模型進(jìn)行分析, 難以全面預(yù)測(cè)各因素水平間的效應(yīng)變化, 存在一定局限性； 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是以非線性模型進(jìn)行擬合, 分析各因素水平對(duì)效應(yīng)值的影響, 精密度優(yōu)于正交試驗(yàn), 可更好地優(yōu)化工藝條件[13-14]。 因此, 本實(shí)驗(yàn)先采用正交試驗(yàn), 再通過星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化生姜紙煨工藝。

2015 年版《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》 中記載, 煨法是用多層浸濕的粗草紙包裹, 置熱火灰中煨至紙呈焦黑色或熟透, 其中熱火灰起到傳熱作用； 本實(shí)驗(yàn)采用固定質(zhì)量的河沙（過3、 6 號(hào)篩） 代替熱火灰傳熱, 來源方便, 可重復(fù)利用, 增加了操作性, 但它能否完全代替熱火灰尚不明確, 還需進(jìn)一步研究。