溫聰聰， 鞠成國， 張 強(qiáng)， 賈 茹， 王 巍

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 大連116600）

訶子收載于2015 年版《中國藥典》 一部, 為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz. 或絨毛訶子Terminalia chebula Retz. var. tomentella Kurt.的干燥成熟果實(shí), 具有澀腸止瀉、 斂肺止咳之功效[1]。 在藏蒙醫(yī)學(xué)中訶子應(yīng)用非常廣泛[2], 其地位相當(dāng)于中藥方劑中的甘草[3]。 傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中, 訶子存在生熟異用, 《本經(jīng)逢原》 中有“生用清金止嗽, 煨熟固腸止瀉” 的記載。 訶子煨后主治久瀉、痢疾、 腸風(fēng)、 瀉血, 即中醫(yī)的“腸澼”, 在現(xiàn)代臨床上與潰瘍性結(jié)腸炎相對應(yīng)[4]。 本實(shí)驗(yàn)以潰瘍性結(jié)腸炎動物模型為對象, 對訶子煨后固腸止瀉藥效物質(zhì)進(jìn)行研究, 比較灌胃給予水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位后藥效學(xué)指標(biāo)的差別, 確定有效部位。 并采用HPLC 分別建立麩煨訶子水提部位、正丁醇部位、 乙酸乙酯部位的指紋圖譜, 利用灰色關(guān)聯(lián)分析法建立共有指紋峰與藥效指標(biāo)之間的關(guān)系, 篩選對藥效貢獻(xiàn)較大的特征峰, 為明確訶子煨后固腸止瀉的炮制原理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

安捷倫1100 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Agilent公司）； FA1004B 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）； 臺式高速微量離心機(jī)（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）； FSH-2A 可調(diào)高速勻漿機(jī)（常州市國旺儀器制造有限公司）； Multiskan Mk 3 型酶標(biāo)儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）。

10 批訶子藥材經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為正品, 信息見表1。 柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號H31020840, 上海福利達(dá)制藥有限公司）；沒 食 子 酸 （批 號17010103）、 鞣 花 酸 （批 號17031010） 均購于成都曼斯特生物科技有限公司。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

小鼠丙二醛 （MDA）、 超氧化物歧化酶（SOD）、 白細(xì)胞介素1β （IL-1β）、 白細(xì)胞介素10（IL-10）、 腫瘤壞死因子α （TNF-α） 試劑盒（上海朗頓生物科技有限公司, 批號分別為20171014TT、 20171014HF、 20171014HS、20171014GP、 20171014JA）； 甲醇為色譜純； 水為純凈水； 乙酸乙酯、 正丁醇、 冰乙酸、 磷酸均為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

SPF 級小鼠, 體質(zhì)量18 ～22 g, 購于遼寧長生生 物 技 術(shù) 有 限 公 司, 批 號 為 SCXK （ 遼）2015-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 麩煨訶子制備 取訶子生品適量, 以藥材∶麥麩（100 ∶40）投入鍋中, 溫度控制在130 ～150 ℃, 麩煨20 min, 即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取各批次麩煨訶子（去核） 適量, 粉碎, 過60 目篩。 稱取藥材粉末20 g,加10 倍量乙酸乙酯浸泡0.5 h, 加熱回流提取3次, 1 h/次, 過濾, 合并濾液； 藥渣晾干, 以正丁醇同法處理； 另取藥材粉末20 g, 以純凈水同法處理, 即得3 個部位提取液。 精密量取各提取液30 mL, 減壓回收溶劑, 以70%甲醇復(fù)溶, 定容于25 mL 量瓶, 搖勻, 精密量取溶液1 mL 置于10 mL量瓶中, 加甲醇至刻度, 搖勻, 用0.45 μm 微孔濾膜過濾, 濾液為供試品溶液。 剩余各部分減壓回收溶劑, 冷凍干燥得各部位提取物, 以備藥效實(shí)驗(yàn)用。

2.1.3 對照品溶液制備 精密稱取對照品沒食子酸、 鞣花酸適量, 加甲醇配制成0.022 4 mg/mL 沒食子酸、 0.035 1 mg/mL 鞣花酸的混合對照品溶液。

2.1.4 色譜條件 安捷倫C18柱 （250 nm ×4.6 mm, 5 μm）； 流 動 相 甲 醇 （A） -磷 酸 水（B）, 梯度洗脫（0～8 min, 95.0% ～90.0%B； 8 ～15 min, 90.0% ～75.0%B； 15 ～25 min, 75.0% B；25 ～30 min, 75.0% ～70.0% B； 30 ～50 min,70.0% ～55.0%B； 50 ～55 min, 55.0%B）； 體積流量1.0 mL/min； 檢測波長270 nm； 柱溫30 ℃； 進(jìn)樣量10 μL[5]。

2.1.5 指紋圖譜 按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1.4” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣, 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2004A 版）進(jìn)行共有峰的匹配。 3 個部位的指紋圖譜來源于10批麩煨訶子樣品, 分別與其生成的對照圖譜比較,水提部位、 正丁醇部位、 乙酸乙酯部位相似度分別在0.924 ～0.992、 0.925 ～0.990、 0.912 ～0.984 之間, 分別有32、 22、 18 個共有峰, 見圖1。

2.2 藥效實(shí)驗(yàn)

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.1 供試藥液制備 將“2.1.2” 項(xiàng)下各部位提取物, 用0.5% 羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 溶液配成質(zhì)量濃度為0.14 g/mL 的藥液（以生藥量計(jì)算）, 再將各批次的藥液合并混勻, 即得3 個部位供試藥液（混合藥液分別對應(yīng)3 個部位指紋圖譜）； 稱取陽性藥柳氮磺胺吡啶片劑適量, 研細(xì),加0.5%CMC-Na 溶液配成0.05 g/mL 藥液, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 動物造模和給藥 小鼠于實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后, 隨機(jī)分為空白組、 模型組、 陽性藥組、水提部位組、 正丁醇部位組、 乙酸乙酯部位組, 每組8 只。 參考文獻(xiàn)[6-7], 采用乙酸灌腸法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型, 空白組小鼠以生理鹽水代替乙酸同法制備。 造模24 h 后, 按體質(zhì)量0.1 mL/10 g灌胃給藥, 各給藥組給予對應(yīng)提取部位的藥液, 陽性藥組以柳氮磺胺吡啶藥液灌胃, 空白組和模型組以0.5% CMC-Na 溶液灌胃, 1 次/d, 連續(xù)7 d, 于第8 d 眼球取血后處死, 解剖取結(jié)腸, 測量長度并稱定質(zhì)量。 取2 cm 結(jié)腸組織, 剪碎, 加磷酸鹽緩沖溶液（PBS） 制成10% 的組織勻漿[8]。 將眼球血和組織勻漿液置于離心管中, 3 000 r/min離心20 min, 吸取上清保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 指標(biāo)測定與數(shù)據(jù)處理 采用ELISA 法對樣本進(jìn)行指標(biāo)測定。 取血清樣本, 按MDA、 SOD 試劑盒說明書操作； 取結(jié)腸組織樣本, 按IL-1β、TNF-α、 IL-10 試劑盒說明書操作。 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2.2.4 對藥效指標(biāo)的影響 表2 ～3 顯示, 與空白組相比, 模型組小鼠血清MDA 顯著升高, SOD 活性顯著降低, 結(jié)腸組織IL-1β、 TNF-α 含有量顯著升高, 而IL-10 含有量顯著降低（P＜0.01）。 與模型組相比, 各給藥組的血清和結(jié)腸組織MDA、 IL-1β、 TNF-α 含有量均顯著降低, SOD 活性、 IL-10含有量均顯著升高（P＜0.01）。 不同部位組間比較, 僅與水提部位組比較, 正丁醇部位組SOD 活性增強(qiáng)存在顯著性差異（P＜0.05）。

表2 麩煨訶子不同部位對血清中MDA、 SOD 的影響 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

表2 麩煨訶子不同部位對血清中MDA、 SOD 的影響 ±s， n=8）Tab.2 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of serumal MDA， SOD ±s， n=8）

注：與空白組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01；與水提組比較,ΔP＜0.05

images/BZ_162_236_1153_1194_1203.png空白組 4.83±0.51 86.68±1.50模型組 33.79±1.28＃＃ 24.77±1.98＃＃陽性藥組 7.41±0.50** 59.62±4.68**水提部位組 10.07±1.23** 60.87±3.47**正丁醇部位組 9.64±1.22** 69.77±4.37**Δ乙酸乙酯部位組 10.45±1.61** 66.78±4.46**

表3 麩煨訶子不同部位對腸組織中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影響s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

表3 麩煨訶子不同部位對腸組織中IL-1β、 TNF-α、 IL-10的影響s， n=8）Tab.3 Effects of different parts of T. chebula roasted with wheat bran on content of intestinal tissues of IL-1β， TNF-α， IL-10 ， n=8）

注：與空白組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,**P＜0.01

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2.3 不同部位指紋圖譜與藥效關(guān)系 參照灰色關(guān)聯(lián)分析法, 本實(shí)驗(yàn)中以藥效指標(biāo)數(shù)值為參考序列,以指紋圖譜共有峰面積數(shù)據(jù)為比較序列[9], 首先對共有峰峰面積進(jìn)行無量綱化處理[10], 再通過灰色關(guān)聯(lián)軟件（V 3.0） 將指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)分別與5 組藥效數(shù)值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 最終以5 組關(guān)聯(lián)度的均值表示二者關(guān)聯(lián)結(jié)果。

結(jié)果見表4, 灰色關(guān)聯(lián)分析得出, 麩煨訶子抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用貢獻(xiàn)度較大的峰（編號）順序?yàn)?1＞9＞25＞30＞14＞31＞28＞3＞32＞13＞26＞15＞8 號, 關(guān)聯(lián)度均在0.70 以上, 表明其所代表的化學(xué)成分抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的關(guān)聯(lián)度較大, 其中32 號峰為鞣花酸, 3 號峰為沒食子酸。

表4 麩煨訶子不同部位共有峰數(shù)據(jù)與其藥效相關(guān)性Tab.4 Correlation between the common peak data of different parts of T. chebula roasted with wheat bran and efficacy

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀主要表現(xiàn)為泄瀉、 腹痛、 便中帶血[11], 本實(shí)驗(yàn)采用乙酸灌腸法復(fù)制小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型, 造成小鼠稀血樣便、 肛門污穢、 體質(zhì)量下降、 皮毛無光澤等狀況, 與潰瘍性結(jié)腸炎的臨床癥狀相符； 與空白組相比, 模型小鼠血清MDA 含有量升高, SOD 活性降低, 結(jié)腸組織中促炎因子IL-1β、 TNF-α 水平升高, 抑炎因子IL-10水平下降。 MDA 是機(jī)體自由基參與過氧脂化反應(yīng)的產(chǎn)物, 具有細(xì)胞毒性, 損害機(jī)體[12]； SOD 是1種活性酶, 可以清除自由基, 活性降低, 清除作用減小, 導(dǎo)致自由基反應(yīng)增加[13-14]； 同時, 結(jié)腸中促炎因子和抑炎因子的失衡導(dǎo)致腸道內(nèi)環(huán)境紊亂,從而加重炎癥[15]。 經(jīng)過給藥治療后, 各給藥組小鼠狀態(tài)與模型組相比得到明顯改善, 各項(xiàng)指標(biāo)與模型組具有顯著性差異, 表明麩煨訶子3 個部位提取物通過減少模型小鼠體內(nèi)自由基的表達(dá), 下調(diào)IL-1β、 TNF-α, 促進(jìn)IL-10 產(chǎn)生, 達(dá)到改善小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用； 比較組間不同部位的各項(xiàng)指標(biāo),除正丁醇組SOD 活性較水提部位組增強(qiáng)具有顯著性差異外, 其余指標(biāo)無顯著性差異, 無法比較出藥效最好的部位, 但是正丁醇部位治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的趨勢較明顯。

本研究藥效實(shí)驗(yàn)存在5 組指標(biāo)數(shù)值, 每組藥效數(shù)值與共有峰數(shù)據(jù)計(jì)算關(guān)聯(lián)度, 得到5 組關(guān)聯(lián)度結(jié)果。 比較發(fā)現(xiàn)不同指標(biāo)對同一個特征峰會表現(xiàn)出不同的關(guān)聯(lián)度, 這表明不同指標(biāo)受到某一成分的調(diào)控作用是不同的, 無從判斷哪一組藥效數(shù)值對應(yīng)的關(guān)聯(lián)度結(jié)果更接近正確值[16]。 因此, 本實(shí)驗(yàn)以5 組關(guān)聯(lián)度的均值[17]作為綜合關(guān)聯(lián)度, 來判斷共有峰對藥效的貢獻(xiàn)度。 可以更好地反映特征峰與抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的關(guān)系, 提高可信度, 故認(rèn)為綜合關(guān)聯(lián)度較大的21、 9、 25、 30、 14、 31、 28、 3、32、 13、 26、 15、 8 號峰代表的化學(xué)成分是麩煨訶子抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的基本藥效成分, 將3個部位中的上述峰的峰面積加和, 正丁醇部位的峰面積總和最大, 表明這些峰所代表的化學(xué)成分在正丁醇部位中含有量最多, 符合藥效實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果, 即正丁醇部分表現(xiàn)出更好的治療趨勢。 但對于上述共有峰, 目前只確定了32 號鞣花酸和3 號沒食子酸, 其他化學(xué)成分的確定有待后期研究。

本課題前期實(shí)驗(yàn)[18]發(fā)現(xiàn)31 號峰在麩煨后峰面積減小, 而與其相連的32 號峰峰面積增加, 二者對抗小鼠潰瘍性結(jié)腸炎作用的貢獻(xiàn)度都較大, 推測二者在訶子麩煨過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化, 對此驗(yàn)證仍需進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過麩煨訶子不同部位譜效關(guān)系研究,初步明確了麩煨訶子固腸止瀉作用的藥效物質(zhì), 以期為進(jìn)一步探討訶子煨后固腸止瀉的炮制原理提供參考。