付士朋， 沈宏偉， 王謙博， 張 爽， 劉 悅， 王 聰， 李俊萍， 王振月*

（1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱150040； 2. 廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州510000）

赤芍為毛茛科芍藥Paeonia lactiflora Pall. 或川赤芍Paeonia vitchii Lynch. 的干燥根, 始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》, 列為中品, 具有活血化瘀、 清熱涼血的功效[1]。 赤芍為大宗常用藥, 其主要生理活性成分包括酚酸類、 單帖苷類及苯肽類[2-3]。 現(xiàn)代研究表明赤芍具有調(diào)節(jié)免疫、 抗炎、 解痙攣以及抗驚厥的作用, 且可改善心肺功能、 抑制癌細胞增殖[4-5]。

飲片是中藥依據(jù)不同需求炮制處理而形成的供配方用的中藥, 是中醫(yī)藥的精華所在, 其質(zhì)量優(yōu)劣對臨床療效有嚴(yán)重的影響。 近年來, 赤芍飲片原料藥材來源混亂及飲片生產(chǎn)不規(guī)范是其質(zhì)量不均一的主要原因。 目前研究主要集中在赤芍總苷類、 黃酮類等有效成分的藥理作用及提取工藝優(yōu)化[6-9], 而關(guān)于炮制工藝研究較少, 張建英等[10]以芍藥苷為評價指標(biāo)考察了潤透切與浸泡切和曬干與烘干的區(qū)別, 實驗參考指標(biāo)過于單一, 不具有全面性[11],對飲片的片型、 干燥時間、 溫度未進詳細的討論。2015 年版《中國藥典》 中對赤芍飲片記載為除去雜質(zhì), 大小分開, 洗凈, 潤透, 切厚片, 干燥。 各環(huán)節(jié)未達到細致量化。 本實驗同時以赤芍中沒食子酸、 氧化芍藥苷、 兒茶素、 芍藥內(nèi)酯苷、 芍藥苷、苯甲酸、 苯甲酰芍藥苷、 丹皮酚為評價指標(biāo), 采用CRITIC 權(quán)重分析法計算其相關(guān)權(quán)重, 單因素實驗考察片型、 干燥方法, 并結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)曲面法考察潤制時間、 干燥溫度、 干燥時間, 優(yōu)化赤芍飲片加工工藝, 建立赤芍飲片炮制加工規(guī)范, 以期為個人及企業(yè)對赤芍的炮制加工提供參考。

1 材料

H1 650 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）； BGZ-140 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）； HY-OBS 遠紅外干燥箱（天津順諾儀器科技有限公司）； B-260 恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器有限公司）； Mettler AE240 電子天平（十萬分之一, 瑞士梅特勒-托利多國際貿(mào)易有限公司）； Wasters e2695 Separations Module 高效液相色譜儀（美國Wasters 公司）； Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美國Thermo 公司）；Phenomenex ODS-C18柱（4.0 mm×3.0 mm, 5 μm,美國Phenomenex 公司）； 乙腈（色譜純, 北京百靈威科技有限公司, L510S136）； 娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。 對照品兒茶素（批號 P10A8F41490 ）、 沒 食 子 酸 （ 批 號Y19M8C36143 ）、 氧 化 芍 藥 苷 （ 批 號Z26O8S46686 ）、 芍 藥 內(nèi) 酯 苷 （ 批 號Y25F8H30152）、 芍藥苷 （批號X12A8C33672）、苯甲酸（批號Z18S7H21155）、 苯甲酰芍藥苷（批號P02D7F26004）、 丹皮酚（批號M13S8Z30031）,含有量≥98%, 均購自上海源葉生物科技有限公司。 赤芍藥材采自黑龍江大興安嶺, 經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)王振月教授鑒定為毛茛科芍藥Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 色譜條件 Thermo C18柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）； 流動相乙腈（A） -0.1%磷酸水（B）, 梯度洗脫 （0 ～10 min, 5% ～15% A； 10 ～25 min,15%A； 25 ～45 min, 15% ～35% A； 45 ～55 min,35% ～50%A； 55 ～60 min, 50% ～60%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫35 ℃； 檢測波長228 nm； 進樣量10 μL。 理論塔板數(shù)按被測物峰計算不低于3 000。

對流動相的考察, 分別用甲醇-水、 甲醇-酸水、 乙腈-水、 乙腈-酸水進行梯度洗脫, 觀察各組分保留時間確定洗脫條件。 結(jié)果表明乙腈-0.1%磷酸水洗脫效果最佳, 峰形對稱且分離度較好, 簡便, 省時。 芍藥內(nèi)酯苷、 芍藥苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍藥苷最大吸收峰分別為231.0、 231.2、 228.8、230.0 nm, 其他成分最大吸收峰相差較大, 分別在211.1～278.6 nm 處有吸收, 所以從吸光度的角度在231 ～228 nm 之間進一步確定最佳測定吸收波長, 經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)兒茶素, 氧化芍藥苷等在228 nm處吸光度較其他處高, 且雜質(zhì)低, 干擾小。 所以選擇228 nm 為最佳吸收波長。 色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品適量,加入甲醇溶解并定溶, 制成每1 mL 含沒食子酸0.021 mg、 氧化芍藥苷0.312 mg、 兒茶素0.221 mg、芍藥內(nèi)置苷0.106 mg、 芍藥苷1.013 mg、 苯甲酸0.101 mg、 苯 甲 酰 芍 藥 苷0.022 mg、 丹 皮 酚0.005 mg的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精確稱取赤芍飲片2 g,置于50 mL 圓底燒瓶中, 精密加入80% 甲醇20 mL, 水?。?0 ℃） 加熱回流提取1 h, 放冷,稱定質(zhì)量, 用80% 甲醇補足減失質(zhì)量, 后將提取液經(jīng)4 000 r/min 離心3 min, 取上清液過0.22 μm微孔濾膜, 即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.2”項 下 混 合 對 照 品 溶 液2.5、 5.0、 10.0、 15.0、20.0、 25.0 μL, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進行回歸。 結(jié)果見表1。 表明各成分在各自的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.2” 項下混合對照品溶液, 在“2.1.1” 項色譜條件下重復(fù)進樣6次。 測得各成分峰面積RSD 分別為0.61%、0.36%、 0.58%、 0.86%、 0.98%、 0.72%、1.02%、 0.46%, 表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一混合對照品溶液適量,在室溫下分別于0、 2、 4、 8、 12 h, 在“2.1.1”項色譜條件下進樣10 μL, 測得各成分峰面積RSD分別為0.57%、 0.74%、 0.69%、 0.73%、 0.75%、0.72%、 0.44%、 0.56%, 表明供試品溶液在室溫下12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取赤芍飲片樣品6 份, 每份2 g, 按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣, 測得各成分峰面積RSD 分 別 為 1.11%、 1.26%、 1.31%、 1.26%、1.39%、 1.34%、 1.22%、 1.52%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的赤芍飲片6 份, 各1 g, 分別按已知含有量的50%、100%、 150% 加入對照品, 按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液, 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣, 每份溶液測定3 次, 計算回收率。 各成分平均加樣回收率 （n = 6） 分別為100.4%、 99.6%、99.4%、 99.3%、 100.7%、 99.7%、 99.2%、99.2%, RSD 分 別 為 0.96%、 0.89%、 1.16%、0.91%、 1.01%、 0.95%、 1.32%、 0.86%。

2.2 權(quán)重指標(biāo)確立 CRITIC 法[12]是1 種客觀的權(quán)重賦值法, 分別以同一評價指標(biāo)比強度和不同評價指標(biāo)之間的沖突性作為基礎(chǔ)綜合衡量的計算方法。 首先對每列指標(biāo)性成分進行無量綱化處理, 標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)= （試驗值-最小值） / （最大值-最小值） ×100, 用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析,得到相關(guān)系數(shù)矩陣（A）, 兩兩成分比較呈正相關(guān),后由Cj得到Wj權(quán)重系數(shù)。 加權(quán)得分公式為Y=W1×沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W2×氧化芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W3×兒茶素標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W4×芍藥內(nèi)酯苷標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W5×芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W6×苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W7×苯甲酰芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)+ W8×丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)

Cj表示第j 個指標(biāo)所包含的信息量, rij表示指標(biāo)i 和j 之間的相關(guān)系數(shù), Wj表示第j 個指標(biāo)的客觀權(quán)重, j 為標(biāo)準(zhǔn)化后列向量的標(biāo)準(zhǔn)差。

2.3 單因素試驗

2.3.1 片型 取赤芍大小分檔, 按相同方法軟化后, 分別切制成薄片, 厚片, 斜薄片, 在烘干箱中60 ℃干燥, 按測定方法對各指標(biāo)進行測定, 其中沒食子酸、 氧化芍藥苷、 兒茶素、 芍藥內(nèi)酯苷、 芍藥苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍藥苷、 丹皮酚客觀權(quán)重分別 為 0.099、 0.183、 0.176、 0.143、 0.102、0.093、 0.100、 0.104, 結(jié)果見表2。 綜合指標(biāo)平均 值 分 別 為 67.407、 49.026、 52.104。 使 用SPSS19.0 軟件對不同片型進行分析, 結(jié)果顯示薄片、 厚片、 與斜片有顯著性差異（P≤0.01）。 實驗中發(fā)現(xiàn)薄片的赤芍飲片容易出現(xiàn)翹片、 裂片的情況, 不利于運輸包裝運輸, 所以選擇相對較好的斜片為赤芍飲片最佳切制方法。

2.3.2 干燥工藝 取赤芍, 潤制6 h 后取出切成斜片, 分別用遠紅外無風(fēng)干燥、 遠紅外有風(fēng)干燥、電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥, 干燥時間6 h, 按各指標(biāo)測定方法進行測定, 其中沒食子酸、 氧化芍藥苷、 兒茶素、 芍藥內(nèi)酯苷、 芍藥苷、 苯甲酸、 苯甲酰芍藥苷, 丹 皮 酚 客 觀 權(quán) 重 分 別 為 0.105、 0.167、0.164、 0.149、 0.101、 0.084、 0.094、 0.094, 結(jié)果見表3。 不同干燥方法的綜合指標(biāo)平均值分別為6.051、 42.002、 91.168, 用SPSS19.0 軟件對不同片型進行分析, 結(jié)果顯示遠紅外無風(fēng)干燥、 遠紅外有風(fēng)干燥、 電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥有顯著性差異（P≤0.01）, 所以選擇綜合指標(biāo)平均值較高的電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥為最佳干燥方法。

表2 不同片型考察Tab.2 Inspection of different types

表3 不同干燥方法考察Tab.3 Investigation of different drying methods

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面法

2.4.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上,選取潤制時間（A）、 干燥溫度（B）、 干燥時間（C） 作為自變量, 用Design-Expert 8.0 中的Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計方法, 以沒食子酸、 氧化芍藥苷、 兒茶素、 芍藥內(nèi)酯苷、 芍藥苷、 苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、 丹皮酚加權(quán)得分為因變量設(shè)計試驗, 其 客 觀 權(quán) 重 分 別 為0.100、 0.103、 0.097、0.109、 0.104、 0.175、 0.183、 0.128。 結(jié) 果 見表4。

2.4.2 數(shù)據(jù)處理與分析 對數(shù)據(jù)進行擬合分析,得到浸潤時間、 干燥溫度、 干燥時間與綜合評價指標(biāo)的二次多元回歸模型方程綜合評價指標(biāo)Y =90.71+15.53 A+9.47 B+7.70 C+6.90 AB+0.20 AC+21.05 BC-33.87 A2-28.80 B2-20.71 C2, 相關(guān)系數(shù)r=0.990, 校正系數(shù)0.981, 表明該試驗?zāi)Ｐ蛿M合度良好, 誤差小, 可應(yīng)用于赤芍飲片工藝優(yōu)化的理論預(yù)測, 對該模型進行方差分析, 見表5。

由方差分析可知, 綜合評分響應(yīng)值P ＜0.000 1, 表明二次回歸方程模型差異極顯著, 而失擬項為0.111 4, 差異不顯著, 表明未知因素干擾性小。 回歸方程較好的反映出潤制時間、 干燥溫度、 干燥時間與綜合評分之間的關(guān)系, 各因素評分的影響順序為潤制時間＞干燥溫度＞干燥時間。 為了進一步研究相關(guān)變量之間的交互作用, 利用響應(yīng)曲面曲線圖和等高線圖來進行可視化分析確定最佳工藝。 響應(yīng)曲面曲線圖可以直觀的反映出兩變量交互作用的程度, 等高線越趨向橢圓, 表明交互作用越強； 越趨向圓, 表明交互作用越弱[13], 結(jié)果見圖2。 Design-Expert 8.0 軟件得出赤芍飲片工藝最佳為潤制10.10 h, 干燥溫度66.45 ℃, 干燥時間6.7 h。 加權(quán)得分95.29。

表4 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.4 Design and results of tests

圖2 各因素響應(yīng)面圖（加工工藝）Fig.2 Response surface plots for various factors （processing technology）

2.4.3 驗證試驗 根據(jù)擬合的最優(yōu)條件, 考慮實際操作, 將炮制工藝調(diào)整為浸潤時間10 h, 干燥溫度66 ℃, 干燥時間6.5 h, 重復(fù)3 次, 結(jié)果見表6。 表明該工藝合理, 可行穩(wěn)定性與重復(fù)性好, 可用于赤芍飲片加工工藝。

3 討論

赤芍常作為清熱藥經(jīng)配伍入藥, 用量極大, 以北京中醫(yī)藥大學(xué)使用量為例, 在2013 至2016 年平均處方用年量4 t[14]。 現(xiàn)今赤芍飲片存在問題較多, 首先是其切制薄厚不規(guī)范, 有些出售的飲片厚度達0.5 cm, 完全不利于飲片在煎煮時有效成分的溶出； 其次是飲片中碎片, 裂片明顯, 飲片不僅對厚度有要求, 還應(yīng)注重外觀形態(tài)。 造成這些問題的原因是部分藥商為節(jié)約成本, 購買統(tǒng)貨自行切制, 缺乏相應(yīng)的赤芍飲片標(biāo)準(zhǔn)。

表5 方差分析Tab.5 Analysis of variance

表6 驗證試驗結(jié)果Tab.6 Results of verification tests

赤芍有效成分較多, 成分復(fù)雜。 因此研究赤芍多種成分需要確定權(quán)重系數(shù), 權(quán)重系數(shù)是中藥多成分評價指標(biāo), 權(quán)重系數(shù)法能客觀利用數(shù)據(jù)信息指導(dǎo)各評價的權(quán)重系數(shù), 是基于數(shù)據(jù)本身相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定權(quán)重的客觀評價方法[15], 現(xiàn)在的工藝炮制多用該法計算權(quán)重系數(shù), 黃瀟等[16]在梔子炭微波炮制優(yōu)化工藝, 陳達等[17]在鹽炙工藝優(yōu)化中均采用此評價方法與Box-Behaken 響應(yīng)面法結(jié)合, 優(yōu)化了多指標(biāo)評價且預(yù)測性良好。 本實驗結(jié)合赤芍各指標(biāo)成分的相關(guān)性確定權(quán)重順序為苯甲酸芍藥苷＞苯甲酸＞丹皮酚＞芍藥內(nèi)酯苷＞芍藥苷＞氧化芍藥苷＞沒食子酸＞兒茶素。

前期實驗采用全因子實驗對赤芍飲片加工過程中可能影響赤芍飲片質(zhì)量的因素進行分析, 通過實驗操作選出7 個影響加工因素（浸泡時間、 潤制時間、 潤制時水溫、 片型、 干燥方法、 干燥溫度、干燥時間）, 結(jié)果顯示潤制時間、 片型、 干燥方法、 干燥溫度、 干燥時間為主要影響因素。 片型與干燥方法2 種因素不呈梯度變化, 所以對其采用單因素試驗方法, 而潤制時間、 干燥時間、 干燥溫度呈梯度變化, 所以采用響應(yīng)曲面法, 結(jié)合2 種方法可對赤芍炮制工藝進行全面而系統(tǒng)的研究。 最終得出浸潤時間10 h, 切斜片, 鼓風(fēng)干燥, 干燥溫度66 ℃, 干燥時間6.5 h 為最佳工藝。 該工藝簡單可行, 質(zhì)量穩(wěn)定, 可為赤芍飲片加工工藝提供參考。