劉鳴昊， 張麗慧， 馬慶亮， 趙文霞

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 河南 鄭州450004）

隨著人民生活水平提高, 非酒精性脂肪性肝病發(fā)生率不斷上升, 成人為20% ～33%[1], 非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化分別占10% ～20% 和2% ～3%[2]。 其中, 非酒精性脂肪性肝炎已經(jīng)成為21 世紀(jì)第二大肝臟疾病[3], 目前對其治療以減肥降脂藥物、 飲食運動、 行為糾正為主, 但他汀類藥物在降脂的同時有著肝損害等副作用, 從而限制了臨床應(yīng)用[4]。

槲皮素是一種黃酮類化合物, 存在于蘆薈等許多中藥中, 具有一定抗炎、 抗氧化作用[5-6], 也能通過抑制炎性因子釋放、 減少脂質(zhì)合成、 改善胰島素抵抗等治療非酒精性脂肪性肝病, 但具體作用機(jī)制尚未闡明。 本實驗探討槲皮素對非酒精性脂肪性肝炎大鼠的影響, 以期明確該成分相關(guān)機(jī)制與靶點。

1 材料

1.1 動物 36 只SPF 級雄性SD 大鼠, 體質(zhì)量（150±10） g, 合格證號11400700116588, 購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司, 飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心, 實驗動物許可證號SXYK（豫） 2015-0005。 實驗前, 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 儀器 ABI 7300 型熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）； PCR 配套分析軟件、 電泳儀、 凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；MK-3 酶標(biāo)儀 （荷蘭Thermo Labsystems 公司）；Fresco 低溫冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）； 全自動BS-220 生化分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）； BX-43 光學(xué)顯微鏡（日本Olympas公司）。

1.3 試藥 水合氯醛（批號20141025） 購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所； F4/80 抗體、 Anti-PI3 Kinase p85 抗 體、 Anti-AKT1/2 抗 體、 Anti-AKT1（phospho T308） 抗 體、 Anti-NF-κB p65 抗 體、Anti-NF-κB p65 （ phospho S536） 抗 體 （ 批 號GR225009-2、 ab180967、 ab188099、 ab66134、ab16502、 ab86299） 購自英國Abcam 公司； 蘇木素染液, 伊紅、 油紅O、 Masson 三色染色試劑盒,DAB 顯 色 試 劑 盒 （批 號20151112、 20141124、08010、 20151207、 16155A01） 購自北京索萊寶科技有限公司； Trizol Reagent RNA 提取試劑（批號103105） 購自美國Life Technologies 公司； 熒光定量RT-PCR 試 劑 盒、 RNA 擴(kuò) 增 試 劑 盒 （批 號4368814、 4367659） 購自美國Applied Biosystems公司； β-Actin 抗體（批號20536-1-AP） 購自美國ProteinTech 公司； PI3K、 AKT1、 AKT2、 β-actin 目的 基 因 引 物 （ 貨 號 E01467-06、 E02414-02、E02414-04、 E01467-08） 委托南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成。 槲皮素（批號PS000434） 購自成都普思生物科技股份有限公司。

2 方法

2.1 造模 大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為空白組、模型組及槲皮素高、 低劑量組, 每組9 只。 空白組大鼠給予普通飼料, 其余各組大鼠給予高脂飼料（1%膽固醇+5%蛋黃粉+10%豬油+84%普通飼料）建模, 持續(xù)10 周。

2.2 給藥 造模第2 周開始灌胃給藥, 槲皮素用1%羧甲基纖維素鈉助溶, 高、 低劑量組分別為80、 40 mg/kg, 而空白組、 模型組均為等體積1%羧甲基纖維素鈉。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 組織學(xué) 造模第10 周結(jié)束后大鼠隔夜禁食, 次日腹腔注射10%水合氯酸（0.3 mL/kg） 麻醉, 取肝組織, 稱取肝濕重以計算肝指數(shù)。 冰生理鹽水沖洗大鼠肝臟, 從肝左葉取3 塊0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 肝組織, 置于4%多聚甲醛中固定,石蠟包埋切片, 進(jìn)行HE、 Masson 染色, 光鏡下觀察肝臟病變程度； 取1 塊相同大小肝組織, 低溫轉(zhuǎn)送至河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科作新鮮冰凍病理切片, 進(jìn)行油紅染色。 參照2010 年修訂版《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[1]中NAS 評分來考察造模是否成功, 標(biāo)準(zhǔn)為（1） 肝細(xì)胞脂肪變性, 0 分 （ ＜5%）, 1 分 （5% ～33%）, 2 分（34% ～66%）, 3 分（＞66%）； （2） 小葉內(nèi)炎癥,0 分（無）, 1 分（＜2 個）, 2 分（2 ～4 個）, 3 分（＞4 個）； （3） 肝細(xì)胞氣球樣變性, 0 分（無）, 1分（少見）, 2 分（多見）, NAS＜3 分可排除非酒精性脂肪性肝炎, NAS＞4 分可診斷, 介于兩者之間者為有可能[7]。 然后, 對大鼠肝組織脂肪變性、炎癥、 纖維化按照標(biāo)準(zhǔn)計分進(jìn)行判定, 并采用雙盲讀片法, 由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2位醫(yī)師同時盲法閱片協(xié)助評估。

2.3.2 免疫組化F4/80 以F4/80 為Kupffer 細(xì)胞標(biāo)志, 免疫組化染色檢測各組大鼠肝臟Kupffer 細(xì)胞活化水平, 按試劑盒說明書進(jìn)行操作（F4/80 一抗∶1%BSA=1 ∶200）。

2.3.3 PI3K, AKT1, p-AKT1, NF-κB p65, p-NF-κB p65 蛋白表達(dá) 采用Western blot 法。 稱取大鼠肝組織50 mg, 加入裂解液, 15 000 r/min 勻漿, 冰上孵育20 min, 4 ℃、 13 000 r/min 離心20 min, 離心后取上清, BCA 法蛋白定量, 調(diào)整蛋白濃度, 煮沸變性5 min。 冰浴冷卻, 上樣量為每泳道20 μg/孔, 濃縮膠恒壓90 V, 約20 min, 分離膠恒壓160 V, 電泳后根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量切膠,轉(zhuǎn)膜, 3%BSA-TBST 封閉30 min, TBST 清洗加入PI3K 一抗（1 ∶1 000）、 AKT1 一抗（1 ∶1 000）、p-AKT1 一抗（1 ∶1 000）、 NF-κB p65 一抗（1 ∶1 000）、 p-NF-κB p65 一抗（1 ∶1 000） 孵育, 過夜, 二抗孵育40 min, ECL 化學(xué)發(fā)光顯影, 放入凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光, 以β-actin 為內(nèi)標(biāo), 通過Image J 軟件分析條帶灰度值計算相對蛋白表達(dá)量。

2.3.4 PI3K、 AKT1、 AKT2、 NF-κB mRNA 表達(dá) 采用熒光定量PCR 法。 取50 mg 大鼠肝組織,液氮研磨至粉狀, 25 ℃下放置3 min 后加1 mL Buffer RLT, 再放置5 min, 使粉狀組織充分與Trizol 溶解, 12 000 r/min 離心5 min, 吸取上清,舍棄沉淀, 余下按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行, 擴(kuò)增條件為95 ℃15 s, 60 ℃1 min, 95 ℃15 s, 40 個循環(huán)后進(jìn)行分析, 2-△△ct法計算結(jié)果,引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 19.0 軟件進(jìn)行處理, 數(shù)據(jù)以s） 表示, 多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。 P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠肝臟組織HE 染色 圖1 顯示, 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰, 肝板排列規(guī)則, 肝細(xì)胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列, 肝細(xì)胞大小形態(tài)正常, 未見脂肪變性； 模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂, 肝板排列不規(guī)則, 小葉內(nèi)肝細(xì)胞腫大, 胞漿內(nèi)可見大小不等脂滴（肝細(xì)胞呈大小泡混合性脂肪變性）, 細(xì)胞核被擠向一邊, 脂變肝細(xì)胞周圍可見點灶狀壞死,少量肝細(xì)胞氣球樣變； 槲皮素低劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)可辨, 肝板排列稍紊亂, 肝細(xì)胞內(nèi)脂滴較模型組減少, 以大小泡性混合性脂變?yōu)橹? 小葉內(nèi)偶見點狀壞死, 匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤； 槲皮素高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較清晰, 肝細(xì)胞呈放射狀排列, 少數(shù)肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大泡性脂滴, 少數(shù)匯管區(qū)偶見個別炎癥細(xì)胞。

圖1 各組大鼠肝臟組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of rat liver tissues in various groups （×200）

3.2 大鼠肝臟組織油紅O 染色 圖2 顯示, 空白組大鼠肝細(xì)胞胞漿、 胞核呈藍(lán)色, 未見明顯橘紅色脂滴； 模型組大鼠肝細(xì)胞胞漿中可見多個大小不等的橘紅色脂滴, 呈彌漫性分布； 槲皮素組大鼠肝細(xì)胞脂滴縮小并減少, 染色變淺, 其中高劑量組僅有少量細(xì)小紅色脂滴呈散在性分布, 與空白組最接近。

3.3 大鼠肝臟組織Masson 染色 圖3 顯示, 空白組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰, 未見明顯膠原纖維沉積；模型組大鼠肝腺泡3 區(qū)竇周纖維化、 匯管區(qū)周圍纖維組織增生, 部分可見橋接纖維化； 與模型組比較, 槲皮素組膠原纖維沉積不同程度減輕。

3.4 NAS 評分 表2 顯示, 與空白組比較, 模型組NAS 評分顯著升高（P＜0.05）, 而且＞4 分, 符合非酒精性脂肪性肝炎組織學(xué)診斷； 與模型組比較, 槲皮素組NAS 評分顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肝臟組織油紅O 染色（×400）Fig.2 Oil red O staining of rat liver tissues in various groups （×400）

圖3 各組大鼠肝臟組織Masson 染色（×200）Fig.3 Masson staining of rat liver tissues in various groups （×200）

表2 各組NAS 評分比較n=9）Tab.2 Comparison of NAS scores among various groups s， n=9）

表2 各組NAS 評分比較n=9）Tab.2 Comparison of NAS scores among various groups s， n=9）

注：與空白組比較,*P＜0.05； 與模型組比較,＃ P＜0.05

images/BZ_72_236_1528_2244_1578.png空白組 — 0.00±0.00 0.17±0.39 0.00±0.00 0.17±0.39模型組 — 2.64±0.50* 2.09±0.30* 1.27±0.47* 6.00±0.78*槲皮素低劑量組 40 1.42±0.35＃ 1.03±0.28＃ 0.77±0.32 3.22±0.56＃槲皮素高劑量組 80 0.78±0.38＃ 0.48±0.42＃ 0.55±0.24＃ 2.97±0.51＃

3.5 大鼠肝臟組織F4/80 染色 表3、 圖4 顯示,空白組大鼠肝組織中央靜脈周圍肝血竇內(nèi)個別細(xì)胞陽性, 呈淡褐色染色, 表明Kupffer 細(xì)胞無明顯活化； 模型組大鼠肝血竇及炎癥壞死灶內(nèi)見大量陽性細(xì)胞, 呈棕褐色染色, Kupffer 細(xì)胞活化程度顯著高于空白組（P＜0.05）； 槲皮素組大鼠Kupffer 細(xì)胞活化程度顯著低于模型組（P＜0.05）。

表3 各組Kupffer 細(xì)胞活化程度比較（n=9）Tab.3 Comparison of Kupffer cell activation degrees among various groups ， n=9）

表3 各組Kupffer 細(xì)胞活化程度比較（n=9）Tab.3 Comparison of Kupffer cell activation degrees among various groups ， n=9）

注：與空白組比較,*P＜0.05； 與模型組比較,＃ P＜0.05

images/BZ_72_1284_2035_2242_2085.png空白組 — 0.06±0.03模型組 — 0.34±0.02*槲皮素低劑量組 40 0.25±0.02＃槲皮素高劑量組 80 0.12±0.03＃

圖4 各組大鼠肝臟組織F4/80 染色（×400）Fig.4 F4/80 staining of rat liver tissues in various groups （×400）

3.6 槲皮素對PI3K、 AKT1、 p-AKT1、 NF-κB p65、 p-NF-κB 蛋白表達(dá)的影響 表4、 圖5 顯示,與空白組比較, 模型組PI3K, AKT1, p-AKT1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）, NF-κB、 p-NF-κB 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較, 槲皮素組PI3K、 p-AKT 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）,NF-κB p65、 p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表4 槲皮素對PI3K、 AKT1、 p-AKT1、 NF-κB p65、 p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響， n=9）Tab.4 Effects of quercetin on PI3K， AKT1， p-AKT1， NF-κB p65 and p-NF-κB p65 protein expressions n=9）

表4 槲皮素對PI3K、 AKT1、 p-AKT1、 NF-κB p65、 p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響， n=9）Tab.4 Effects of quercetin on PI3K， AKT1， p-AKT1， NF-κB p65 and p-NF-κB p65 protein expressions n=9）

注：與空白組比較,*P＜0.05； 與模型組比較,＃ P＜0.05

images/BZ_73_236_452_2244_510.png空白組 — 1.13±0.21 0.89±0.09 0.54±0.02 0.11±0.02 0.50±0.10模型組 — 0.29±0.04* 0.66±0.07* 0.20±0.04* 0.50±0.09* 1.02±0.11*槲皮素低劑量組 40 0.64±0.10＃ 0.62±0.07 0.31±0.12＃ 0.34±0.08＃ 0.38±0.08＃槲皮素高劑量組 80 0.72±0.08＃ 0.67±0.08 0.64±0.12＃ 0.15±0.06＃ 0.24±0.03＃

圖5 各組大鼠肝臟組織ADPN、 AdipoR2 蛋白表達(dá)Fig.5 ADPN and AdipoR2 protein expressions of rat liver tissues in various groups

3.7 槲皮素對PI3K、 AKT1、 AKT2、 NF-κB mRNA表達(dá)的影響 表5 顯示, 與空白組比較, 模型組PI3K、 AKT1、 AKT2 mRNA 表 達(dá) 顯 著 降 低 （P＜0.05）, NF-κB mRNA 表達(dá)顯著升高（P ＜0.05）；與模型組比較, 槲皮素高劑量組PI3K、 AKT1、AKT2 mRNA 表達(dá)顯著升高 （P ＜0.05）, NF-κB mRNA 表達(dá)顯著降低（P ＜0.05）, 而低劑量組僅AKT2 mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

4 討論

隨著對非酒精性脂肪性肝炎的研究不斷深入,發(fā)現(xiàn)其形成、 發(fā)展與胰島素抵抗、 氧化應(yīng)激、 脂質(zhì)過氧化外, 細(xì)胞自噬與調(diào)亡、 各類脂肪因子、 遺傳、 個人因素等相關(guān), 但“二次打擊” 依然是目前公認(rèn)的經(jīng)典學(xué)說[8], “第一次打擊” 為肥胖、 2型糖尿病、 高脂血癥等伴隨的瘦素及胰島素抵抗,引起肝內(nèi)脂肪蓄積, “第二次打擊” 為脂肪堆積的肝臟發(fā)生慢性炎癥反應(yīng), 脂質(zhì)過氧化損傷, 微粒體、 線粒體功能受抑, 肝細(xì)胞凋亡, 星狀細(xì)胞激活, 從而誘發(fā)該疾病和肝纖維化[9]。

表5 槲皮素對PI3K、 AKT1、 AKT2、 NF-κB mRNA 表達(dá)的影響s， n=9）Tab.5 Effects of quercetin on PI3K， AKT1， AKT2 and NF-κB mRNA expressions n=9）

表5 槲皮素對PI3K、 AKT1、 AKT2、 NF-κB mRNA 表達(dá)的影響s， n=9）Tab.5 Effects of quercetin on PI3K， AKT1， AKT2 and NF-κB mRNA expressions n=9）

注：與空白組比較,*P＜0.05； 與模型組比較,＃ P＜0.05

images/BZ_73_236_1696_2244_1754.png空白組 — 1.00±0.23 1.00±0.31 1.00±0.20 1.00±0.20模型組 — 0.47±0.24* 0.46±0.15* 0.29±0.17* 1.89±0.46*槲皮素低劑量組 40 0.68±0.21 0.58±0.14 0.78±0.24＃ 1.42±0.24槲皮素高劑量組 80 0.98±0.22＃ 0.82±0.23＃ 1.13±0.31＃ 1.02±0.26＃

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） 具有脂類激酶活性與蛋白激酶活性, 可被各種理化因素和細(xì)胞因子激活, 產(chǎn)生PIP2、 PIP3, 發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)第二信使的功能； 作用于PI3K/AKT 通路, 從而使多種細(xì)胞功能（如凋亡、 增殖、 代謝、 分泌、 趨化等） 得到發(fā)揮, 并在炎癥、 代謝和腫瘤疾病的發(fā)病過程中扮演重要角色[10-11]。 絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT 是PI3K/AKT 信號通路的主要的下游分子, 包括AKT1、 AKT2、 AKT3 3 種亞型, 其中AKT1 可在多種組織中普遍表達(dá)； AKT2 主要在胰島素敏感型組織表達(dá), 在其余組織中呈低表達(dá)； AKT3 只表達(dá)于大腦和睪丸中。 核因子κB （NF-κB） 是一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子, 由p50/p65 構(gòu)成的異二聚體, 可被包括PI3K/AKT 信號通路在內(nèi)的多種刺激因素激活[12], 與IκB 解離后變?yōu)榛钚誀顟B(tài), 轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核, 進(jìn)而結(jié)合核內(nèi)的κB 位點, 再進(jìn)一步調(diào)控下游的靶基因表達(dá), 從而參與肝臟炎癥、 肝臟纖維化以及細(xì)胞凋亡等病理過程的發(fā)生[13]。 動物實驗研究發(fā)現(xiàn), 非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織NF-κB mRNA 表達(dá)明顯增加[14]； 大量臨床研究表明, 患者NF-κB 活性也明顯上升, 提示它在疾病發(fā)生過程中扮演了重要角色, 其機(jī)理可能是出現(xiàn)了脂質(zhì)過氧化, 激活了NF-κB[15], 刺激了炎癥因子出現(xiàn),從而加重炎癥作用, 然后這些因子在原有基礎(chǔ)上再次激活NF-κB, 造成正反饋調(diào)節(jié), 使炎癥信號不斷擴(kuò)大[16]。

本實驗通過HE、 油紅O、 Masson 染色發(fā)現(xiàn),槲皮素能改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟脂質(zhì)沉積, 減輕炎癥細(xì)胞浸潤, 改善肝臟纖維化病變； 有效改善肝細(xì)胞脂肪變性、 小葉內(nèi)炎癥、 肝細(xì)胞氣球樣變, 減少Kupffer 細(xì)胞活化水平； 高劑量下還能提高肝組織PI3K、 AKT1 表達(dá), 降低NF-κB p65 表達(dá), 其機(jī)制可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/NF-κB 信號傳導(dǎo)通路、 抑制炎癥反應(yīng)所致。