馬歷歷， 李 浩， 孫立明， 董 陽， 衣柏慧

（吉化集團公司總醫(yī)院神經內科， 吉林 吉林132000）

腦血管病是中老年人群常見慢性病, 危害嚴重, 以缺血性腦血管病發(fā)病率最高, 約占80%[1],故及時恢復腦組織缺血（即血液再灌注） 可減少腦損傷, 但在某些情況下缺血后血流恢復時反而進一步引起功能障礙和組織損傷, 稱為腦缺血再灌注損傷[2]。 目前, 治療腦缺血再灌注損傷的藥物往往毒副作用較大, 作用機制單一, 效果不佳, 而中藥可從多環(huán)節(jié)、 多層次、 多靶點上發(fā)揮作用[3],故闡明相關作用機制具有重大意義。

中醫(yī)認為, 黃芪具有利尿托毒、 益氣補中等作用, 臨床上用于治療氣虛、 脾虛、 肺虛、 陽虛、 體虛等多種虛證, 其主要活性成為氨基酸、 皂苷、 多糖、 黃酮[4], 其中黃酮具有多種生理作用, 如抑制黑色素生成、 降血糖、 抗過敏、 抗病毒、 抗癌等[5], 而且黃芪總黃酮也具有抑制氧化應激、 減少炎癥反應及抗凋亡等活性[6-8]。 氧化應激、 炎癥反應、 凋亡與腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展密切相關[9], 但關于黃芪總黃酮對腦缺血再灌注損傷影響的報道較少, 故本實驗旨在探討該成分對腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應激、 炎癥反應及凋亡的影響, 為其臨床應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 動物 雄性健康SD 大鼠, SPF 級, 體質量180～220 g, 購于吉林大學實驗動物中心, 動物生產許可證號SYXK （吉） 2016-0001, 定時喂食,飲水不限, 在清潔級動物室飼養(yǎng)。

1.2 試藥 黃芪總黃酮購自上海源葉生物科技有限公司, 批號20170125, 含有量≥90.0%； 尼莫地平購自亞寶藥業(yè)集團股份有限公司, 批號20161218。 丙二醛（MDA）、 谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、 超氧化物岐化酶（SOD） 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 白細胞介素-1β（IL-1β）、 腫瘤壞死因子-α （TNF-α） 檢測試劑盒購自美國R＆D 公司； M-MLV 逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen 公司； 磷酸化-磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）、 磷酸化-蛋白激酶B （p-AKT） 多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.3 儀器 752 N 紫外-可見分光光度計（上海精科儀器公司）； BG-XM496 酶標儀（常州三豐儀器公司）； LightCycler?480 實時熒光定量PCR （瑞士羅氏公司）； DYCZ-40 A 轉移電泳儀（北京六一生物科技公司）。

2 方法

2.1 分組、 給藥、 造模 將適應環(huán)境1 周后的大鼠隨機分為假手術組、 模型組, 尼莫地平 （15 mg/kg） 組及黃芪總黃酮高（60 mg/kg）、 低劑量（30 mg/kg） 組, 造模前15 d 灌胃給藥, 1 次/d。末次給藥后, 按照Longa 等[10]報道的線栓法制備腦缺血模型, 于缺血2 h 后拔出線栓, 恢復血流供應, 進行24 h 再灌注。

2.2 神經行為學評分、 腦含水量檢測 再灌注24 h 后, 各組隨機選取8 只大鼠, 神經行為學評分采用Berderson 評分法[11]。 然后, 各組大鼠經戊巴比妥鈉（60 mg/kg） 麻醉后斷頭取腦, 干濕重法測定腦組織含水量。

2.3 腦組織抗氧化活性、 炎癥因子水平檢測 再灌注24 h 后, 各組隨機選取8 只大鼠, 經戊巴比妥鈉（60 mg/kg） 麻醉后斷頭取腦, 取部分腦組織, 精密稱定質量后, 加入10 倍量預冷生理鹽水,勻漿后制備10%腦組織勻漿液, 4 ℃、 3 000 r/min離心5 min, 吸取上清液, 于-20 ℃冰箱中保存。按照試劑盒操作步驟, 分光光度法檢測腦組織MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性, 放射免疫法檢測IL-1β、 TNF-α 水平。

2.4 腦組織Bcl-2、 Bax、 caspase-3 mRNA 表達檢測 取大鼠剩余腦組織, 液氮下反復研磨, Trizol法提取總RNA, 經M-MLV 逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。 在LightCycler?480 實時熒光定量儀中,SYBR 法檢測腦組織凋亡相關基因caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達。 然后, 通過2-△△Ct法計算目的基因相對表達量, 以GAPDH 為內標, 所需引物由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成, 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 腦組織p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達檢測 取“2.3” 項下10%腦組織勻漿液, 考馬斯亮藍法測定總蛋白量, 12% SDS-PAGE 垂直板電泳后轉至PVDF 膜, 脫脂奶粉封閉2 h, PBST 洗膜2 次（10 min/次）, 4 ℃下將膜放入p-PI3K、 p-AKT 稀釋液中（1 ∶1 000） 孵育12 h, PBST 洗膜后, 常溫下將膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液中（1 ∶500） 孵育2 h, PBST 洗膜后進行DAB 染色。拍照后, 通過圖像處理軟件進行分析, 以目的蛋白條帶、 內標蛋白條帶灰度值之比表示相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理,數(shù)據以表示, 2 組間比較采用LSD 法, 多組間比較采用單因素方差分析。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 黃芪總黃酮對神經行為學評分、 腦組織含水量的影響 表2 顯示, 與假手術組比較, 模型組神經行為學評分、 腦組織含水量顯著升高 （P ＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者顯著降低（P＜0.05）。

表2 黃芪總黃酮對神經行為學評分及腦組織含水量的影響s， n=8）Tab.2 Effects of Astragali Radix total flavonoids on neurobehavioral score and water content in brain tissue ±s， n=8）

表2 黃芪總黃酮對神經行為學評分及腦組織含水量的影響s， n=8）Tab.2 Effects of Astragali Radix total flavonoids on neurobehavioral score and water content in brain tissue ±s， n=8）

注：與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

images/BZ_62_236_976_2244_1025.png假手術組 — 0 68.68±8.82模型組 — 2.75±0.32* 85.20±9.23*尼莫地平組 15 1.74±0.19＃ 71.78±8.53＃黃芪總黃酮高劑量組 60 2.28±0.40＃ 72.46±6.71＃黃芪總黃酮低劑量組 30 2.47±0.31＃ 73.05±8.39＃

3.2 黃芪總黃酮對MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響 表3 顯示, 與假手術組比較, 模型組MDA 水平顯著升高（P＜0.05）, GSH-Px、 SOD 活性顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組MDA 水平顯著降低 （P ＜0.05）, GSH-Px、SOD 活性顯著升高（P＜0.05）。

表3 黃芪總黃酮MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響±s， n=8）Tab.3 Effects of Astragali Radix total flavonoids on MDA level and GSH-Px， SOD activities （±s， n=8）

表3 黃芪總黃酮MDA 水平及GSH-Px、 SOD 活性的影響±s， n=8）Tab.3 Effects of Astragali Radix total flavonoids on MDA level and GSH-Px， SOD activities （±s， n=8）

注：與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

images/BZ_62_236_1670_2244_1720.png假手術組 — 11.15±1.28 95.61±10.30 224.95±26.26模型組 — 18.58±2.18* 41.33±5.47* 105.42±12.71*尼莫地平組 15 13.66±1.25＃ 76.79±8.66＃ 196.72±20.63＃黃芪總黃酮高劑量組 60 14.36±1.37＃ 70.18±9.34＃ 190.85±22.38＃黃芪總黃酮低劑量組 30 15.45±1.68＃ 58.67±7.85＃ 178.06±19.42＃

3.3 黃芪總黃酮對IL-1β、 TNF-α 水平的影響 表4 顯示, 與假手術組比較, 模型組IL-1β、 TNF-α水平顯著升高（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者水平顯著降低（P＜0.05）。

表4 黃芪總黃酮對IL-1β、 TNF-α 水平的影響（s， n=8）Tab.4 Effects of Astragali Radix total flavonoids on IL-1β and TNF-α levels ， n=8）

表4 黃芪總黃酮對IL-1β、 TNF-α 水平的影響（s， n=8）Tab.4 Effects of Astragali Radix total flavonoids on IL-1β and TNF-α levels ， n=8）

注：與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1）IL-1β/（pg·mg prot-1）TNF-α/（mg·mg prot-1）假手術組 — 27.04±3.49 126.55±14.15模型組 — 52.69±6.64* 218.70±25.52*尼莫地平組 15 34.28±3.62＃ 144.13±14.16＃黃芪總黃酮高劑量組 60 36.76±4.95＃ 153.08±17.64＃黃芪總黃酮低劑量組 30 39.44±4.87＃ 169.84±16.39＃

3.4 黃芪總黃酮對caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA表達的影響 表5 顯示, 與假手術組比較, 模型組caspase-3、 Bax mRNA 表達顯著升高（P ＜0.05）,Bcl-2 mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組caspase-3、 Bax mRNA 表達顯著降低 （P ＜0.05）, Bcl-2 mRNA 表達顯著升高（P＜0.05）。

表5 黃芪總黃酮對caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達的影響（s， n=8）Tab.5 Effects of Astragali Radix total flavonoids on caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA expressions s， n=8）

表5 黃芪總黃酮對caspase-3、 Bcl-2、 Bax mRNA 表達的影響（s， n=8）Tab.5 Effects of Astragali Radix total flavonoids on caspase-3， Bcl-2 and Bax mRNA expressions s， n=8）

注：與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1） caspase-3 Bcl-2 Bax假手術組 — 0.62±0.07 0.94±0.11 0.39±0.04模型組 — 1.48±0.15* 0.32±0.03* 1.20±0.14*尼莫地平組 15 0.87±0.00＃ 0.81±0.09＃ 0.63±0.07＃黃芪總黃酮高劑量組 60 1.04±0.11＃ 0.73±0.07＃ 0.78±0.08＃黃芪總黃酮低劑量組 30 1.16±0.13＃ 0.60±0.06＃ 0.91±0.10＃

3.5 黃芪總黃酮對p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達的影響 表6、 圖1 顯示, 與假手術組比較, 模型組p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

表6 黃芪總黃酮對p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達的影響±s， n=8）Tab.6 Effects of Astragali Radix total flavonoids on p-PI3K and p-AKT protein expressions （，n=8）

表6 黃芪總黃酮對p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達的影響±s， n=8）Tab.6 Effects of Astragali Radix total flavonoids on p-PI3K and p-AKT protein expressions （，n=8）

注：與假手術組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/（mg·kg-1）p-PI3K/GAPDH p-AKT/GAPDH假手術組 — 1.45±0.16 1.24±0.10模型組 — 0.34±0.04* 0.22±0.02*尼莫地平組 15 0.97±0.11＃ 0.85±0.09＃黃芪總黃酮高劑量組 60 0.78±0.07＃ 0.61±0.07＃黃芪總黃酮低劑量組 30 0.56±0.06＃ 0.32±0.06＃

圖1 各組p-PI3K、 p-AKT 蛋白表達Fig.1 p-PI3K and p-AKT protein expressions in various groups

4 討論

由于局灶性腦缺血動物模型不需要開顱, 可極大減少顱內感染幾率, 同時重復性較好, 故使用頻率最高[12]。 本實驗采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型, 發(fā)現(xiàn)大鼠神經功能嚴重損傷, 腦組織含水量增加, 提示建模成功； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組大鼠神經行為學評分、 腦組織含水量明顯下降, 表明該成分對大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。

氧化應激是腦缺血再灌注損傷的主要病理機制, 由于腦組織代謝旺盛、 需氧量高, 導致生成較多的ROS, 但腦組織自身缺少抗氧化物質, 更容易受到后者侵害[13], 而且它也會在中樞神經系統(tǒng)和代謝反應應激狀態(tài)下產生, 直接損傷蛋白質、 脂質、 核酸等細胞內大分子, 導致細胞死亡[14]；MDA 是脂質過氧化反應的終產物, 其水平高低可反映氧化應激程度； GSH-Px、 SOD 是體內最重要的抗氧化物酶, 可清除細胞中ROS, 具有保護細胞免受氧化損傷的作用[15]。 本實驗發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織MDA 水平明顯升高, 而GSH-Px、 SOD活性明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組大鼠腦組織MDA 水平明顯下降, 而GSH-Px、 SOD 活性明顯升高, 表明該成分對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與抑制氧化應激水平有關。

炎癥反應是存在于腦缺血再灌注損傷中的另一重要機制, 會導致毒性酶激活、 自由基超載等, 從而引起一系列組織病變。 在腦缺血狀態(tài)下, 星形膠質細胞等炎性細胞會分泌大量IL-1β, 它是參與炎癥級聯(lián)擴大反應和腦缺血早期炎癥反應的重要炎癥因子[16]； TNF-α 是由巨噬細胞、 單核細胞分泌的一種促炎因子, 在腦缺血發(fā)生時炎性相關細胞被過度激活, 從而使其分泌增加, 進而刺激腦組織局部炎癥反應, 加重腦損傷[17], 而且當IL-1β 被激活時會促進TNF-α 分泌, 同時兩者又會增加其他炎癥因子表達, 使腦損傷程度加重[18]。 本實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠腦組織IL-1β、 TNF-α 水平明顯升高；與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者水平明顯下降,表明該成分對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與減少炎癥反應有關。

凋亡也是腦缺血再灌注損傷伴隨的重要機制,在發(fā)生腦缺血時缺血中樞區(qū)周圍的神經元死亡以凋亡為主[19]。 caspase 家族成員蛋白在線粒體依賴途徑和非線粒體依賴途徑的凋亡進程中均起著主導作用, 其中caspase-3 是用來檢測細胞凋亡的重要指標之一[20]。 Bcl-2 家族分為抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白, 在細胞凋亡進程中同樣發(fā)揮著重要的調節(jié)作用, 當細胞處于腦缺血等應激狀態(tài)時, 抑凋亡蛋白Bcl-2 表達降低, 而促凋亡蛋白Bax 表達增加[21]。本實驗發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織caspase-3、 Bax mRNA 表達明顯升高, 而Bcl-2 mRNA 表達明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組前兩者mRNA表達明顯下降, 而后者mRNA 表達明顯升高, 表明該成分對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與抗凋亡作用有關。

研究表明, PI3K/AKT 信號轉導通路參與了腦缺血時神經細胞的凋亡進程, 其中AKT 既可促進caspase-3 等凋亡蛋白磷酸化, 使其失活, 也能促進抗凋亡基因（如Bcl-2） 轉錄和表達, 使細胞存活[22]。 本實驗發(fā)現(xiàn), 模型組大鼠腦組織p-PI3K、p-AKT 蛋白表達明顯下降； 與模型組比較, 黃芪總黃酮組兩者蛋白表達明顯升高, 表明該成分對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用與激活PI3K/AKT 信號通路引起的抗凋亡作用有關。

綜上所述, 黃芪總黃酮對大鼠腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用, 其機制可能與抑制氧化應激水平、 減少炎癥反應、 抗凋亡作用有關。