王志國(guó)， 黃賢明*， 趙 雁， 王其亮， 竇曉靜， 王 俊， 盧 娜

[1. 青島市中醫(yī)醫(yī)院（海慈醫(yī)療集團(tuán)） 急診科， 山東 青島266003； 2. 青島市中醫(yī)醫(yī)院（海慈醫(yī)療集團(tuán)）血液透析室， 山東 青島266003； 3. 青島市中醫(yī)醫(yī)院（海慈醫(yī)療集團(tuán)） 藥劑科， 山東 青島266003]

結(jié)直腸癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤, 其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)位于前三位, 其發(fā)生的主要因素有遺傳、 環(huán)境、 生活方式等, 目前常規(guī)治療方法大多為手術(shù)、 放療、 化療等, 但常出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、 對(duì)放療不敏感、 化療抵抗性等現(xiàn)象, 臨床療效不理想[1], 故尋找安全有效的治療方法和新藥成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。 目前, 中藥及其提取物治療癌癥備受關(guān)注[2]。

異甘草素是從甘草中提取出的一種異黃酮類成分, 具有抗氧化、 抗炎、 抗腫瘤作用, 并能擴(kuò)張動(dòng)脈, 起到保護(hù)心臟、 大腦的作用[3], 可抑制多種消化道腫瘤活性, 如結(jié)腸癌、 胃癌等[4], 但其在結(jié)直腸癌中抗癌機(jī)制目前尚不清楚。 MAPK/ERK信號(hào)通路在多種細(xì)胞中具有調(diào)控細(xì)胞增殖、 凋亡、分化、 侵襲、 遷移等非常重要的作用[5-6]。 研究表明在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中與MAPK/ERK 信號(hào)通路異常激活密切相關(guān)[7], 在肝細(xì)胞中異甘草素可通過(guò)調(diào)控MAPK/ERK、 JNK/MAPK 等信號(hào)通路激活來(lái)發(fā)揮抗炎作用[8]。 因此, 本實(shí)驗(yàn)探討異甘草素對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞、 MAPK/ERK 信號(hào)通路的影響, 以期研究其作用機(jī)制。

1 材料

異甘草素（含有量大于98%）、 二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司； 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116、HT29 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所； RPMI 1640 培養(yǎng)基、 胎牛血清、 胰蛋白酶、 青霉素、 鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司； Matrigel 購(gòu)自美國(guó)BD 公司； Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司； MTT 檢測(cè)試劑盒、 細(xì)胞蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天生物工程有限公司； Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司； BCA 蛋白定量試劑盒、 ELC 發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)CST 公司； cleaved caspase-3、pJNK、 JNK、 pERK1/2、 ERK1/2、 pP38、 P38 抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116、 HT29 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（含1% 青霉素、 鏈霉素雙抗） 中, 置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞毒性檢測(cè) 采用MTT 法。 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116、 HT29 細(xì)胞, 以完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105/mL, 在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種200 μL 細(xì)胞, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 待細(xì)胞貼壁后加入含異甘草素10、 20、 40、60、 80、 100、 120 μmol/L 的培養(yǎng)基, 對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基, 每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。 異甘草素處理48 h 后, 添加20 μL MTT 溶液, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h, 除去培養(yǎng)液后再加入150 μL 二甲基亞砜, 避光充分混勻, 振蕩反應(yīng)至結(jié)晶紫完全溶解, 于570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD） 值, 計(jì)算抑制率, 公式為抑制率= [（1-實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值） ] ×100%, 再計(jì)算IC50值。

2.3 HCT116 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116 細(xì)胞, 0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液, 接種于6 孔板中, 密度1×104/mL, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng), 細(xì)胞貼壁后分別加入含異甘草素10、 15、 20 μmol/L 的培養(yǎng)基, 對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基, 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后通過(guò)Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 收集各組處理后的細(xì)胞, PBS 洗滌2 次,約400 μL 結(jié)合緩沖液混勻, 再依次加入Annexin VFITC、 PI 各5 μL, 室溫下避光孵育15 min, 流式細(xì)胞儀測(cè)定HCT116 細(xì)胞凋亡率。

2.4 HCT116 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot 法。 將HCT116 細(xì)胞以5×104/mL 的密度接種于6 cm 培養(yǎng)皿中, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 將終濃度10、 15、 20 μmol/L 的異甘草素加到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h, 收集細(xì)胞, 加入細(xì)胞裂解液, 冰上裂解30 min, 離心并提取細(xì)胞總蛋白。BCA 試劑盒對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量測(cè)定, 取35 μg 總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳, 半干法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上, 將膜加到含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉4 h, 依次加入一抗cleaved caspase-3 （1 ∶1 000 倍稀釋）、 pJNK （1 ∶800 倍稀釋）、 JNK （1 ∶800 倍稀釋）、 pERK1/2 （1 ∶500倍稀釋）、 ERK1/2 （1 ∶500 倍稀釋）、 pP38 （1 ∶1 000 倍稀釋）、 P38 （1 ∶1 000 倍稀釋）, 4 ℃下孵育過(guò)夜, TBST 洗滌3 次, 加入二抗（1 ∶3 000倍稀釋）, TBST 洗滌3 次后, ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光, 轉(zhuǎn)移至暗室中, 在成像儀中曝光拍照,以GAPDH 為內(nèi)標(biāo), 通過(guò)Image J 圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值, 以相對(duì)灰度值表示待測(cè)蛋白cleaved caspase-3、 pJNK、 JNK、 pERK1/2、 ERK1/2、 pP38、 P38 蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.5 HCT116 細(xì)胞遷移、 侵襲檢測(cè) 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。 在冰上以不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel 膠, 將稀釋好的基質(zhì)膠以每孔40 μL 的密度鋪于Transwell 小室的上室中, 將小室放到24 孔板中, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置, 待基質(zhì)膠完全風(fēng)干后取出。 將各組HCT116 細(xì)胞饑餓24 h, 0.25%胰蛋白酶消化, PBS 洗滌3 次, 無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 制成單細(xì)胞懸液。 在Transwell 上室加入200 μL細(xì)胞懸液（密度為2×105/mL）, Transwell 下室中加入含終濃度0、 10、 15、 20 μmol/L 異甘草素的培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）, 置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育48 h。 取出Transwell 小室, 吸去上室液體,棉簽擦去上室未侵襲的細(xì)胞, 在Transwell 小室的下室加入500 μL 甲醇固定15 min, 0.1%結(jié)晶紫染色15 min, 去離子水洗滌數(shù)次后晾干, 倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野, 拍照, 計(jì)數(shù), 以穿膜細(xì)胞數(shù)表示HCT116 細(xì)胞侵襲能力； Transwell 上室不加Matrigel 基質(zhì)膠涂層以檢測(cè)細(xì)胞遷移能力, 步驟同上, 并以穿膜細(xì)胞數(shù)表示HCT116 細(xì)胞遷移能力。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過(guò)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,多組差異比較采用單因素方差分析, 組間差異比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 異甘草素對(duì)HCT116、 HT29 細(xì)胞的毒性 圖1 顯示, 不同濃度異甘草素處理48 h 后, 隨著其濃度增加對(duì)HCT116、 HT29 細(xì)胞增殖的抑制率逐漸升高, 在10 ～120 μmol/L 范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性作用, 并呈濃度依賴性, 對(duì)兩者的IC50分別為22.45、 23.69 μmol/L。 本 實(shí) 驗(yàn) 選 擇10、 15、20 μmol/L 異甘草素作用于HCT116 細(xì)胞, 進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 異甘草素對(duì)各細(xì)胞的毒性Fig.1 Toxicities of isoglycyrrhizin on various cells

3.2 異甘草素對(duì)HCT116 細(xì)胞凋亡的影響 圖2顯示, 與對(duì)照組比較, 異甘草素組cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）； 與對(duì)照組比較,異甘草素組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）, 并呈濃度依賴性。

3.3 異甘草素對(duì)HCT116 細(xì)胞遷移、 侵襲的影響圖3 顯示, 與對(duì)照組比較, 異甘草素組細(xì)胞遷移、 侵襲能力顯著下降（P＜0.05）。

3.4 異甘草素對(duì)HCT116 細(xì)胞中MAPK/ERK 信號(hào)通路的影響 圖4 顯示, 隨著異甘草素濃度增加,pJNK、 pERK1/2、 pP38 水 平 逐 漸 降 低, pJNK/JNK、 pERK1/2/ERK1/2、 pP38/P38 比值亦然, 與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

結(jié)直腸癌發(fā)病率、 死亡率在世界各國(guó)均較高,是影響人類健康和生命的高發(fā)性惡性腫瘤之一。 患者死亡率較高的主要原因是復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移, 故能有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、 轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵所在[9]。異甘草素是甘草中含有量較高的一種黃酮類成分,具有廣泛的抗病毒、 抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、 抗自由基、抗炎、 抗腫瘤等活性, 而且不良反應(yīng)較少[10], 另外甘草酸、 甘草次酸、 甘草苷也有一定活性[11],該成分可通過(guò)靶向調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體, 抑制肺癌細(xì)胞增殖[12]； 下調(diào)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá),抑制乳腺癌誘導(dǎo)的血管生成[13]； 抑制JNK/AP-1信號(hào)通路激活, 抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力[14]；降低miR-374a 表達(dá), 抑制異常Akt 信號(hào)傳導(dǎo), 從而增加PTEN 表達(dá), 并抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[15]。 近期研究顯示, 異甘草素能通過(guò)下調(diào)環(huán)氧合酶-2 和一氧化氮合酶的表達(dá)來(lái)阻礙結(jié)腸癌發(fā)生[16]； 本實(shí)驗(yàn)以不同濃度異甘草素干預(yù)人結(jié)直腸癌細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)該成分能呈濃度依賴性地抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、 轉(zhuǎn)移和侵襲, 并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

caspase-3 作為凋亡執(zhí)行蛋白, 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 研究表明, 異甘草素能調(diào)控肝癌細(xì)胞、 腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、 黑色素瘤細(xì)胞中caspase-3 活性, 上調(diào)cleaved caspase-3 表達(dá), 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-19]； 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 異甘草素干預(yù)結(jié)直腸癌HCT116 細(xì)胞后, cleaved caspase-3 表達(dá)增強(qiáng),表明該成分可通過(guò)上調(diào)其表達(dá)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

圖2 異甘草素對(duì)HCT116 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of isoglycyrrhizin on HCT116 cell apoptosis

注： ISL 為異甘草素。 與對(duì)照組比較,*P＜0.05

圖4 異甘草素對(duì)MAPK/ERK 信號(hào)通路的影響Fig.4 Effects of isoglycyrrhizin on MAPK/ERK signaling pathway

MAPK/ERK 信號(hào)通路參與多種腫瘤細(xì)胞增殖、分化、 凋亡、 侵襲、 轉(zhuǎn)移等, 包括JNK、 ERK1/2、P38 等關(guān)鍵分子, 當(dāng)這些分子發(fā)生磷酸化后可調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá), 進(jìn)而影響細(xì)胞周期、 cleaved caspase-3、 基質(zhì)金屬蛋白酶等表達(dá), 介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、 凋亡、 轉(zhuǎn)移等過(guò)程[20]。 研究表明, 甘草苷能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1、 ERK2 及ERK1/2、 MEK-2 等表達(dá)來(lái)調(diào)控MAPK/ERK 信號(hào)通路激活水平, 抑制子宮腺肌病病灶細(xì)胞的異常增殖, 減緩子宮腺肌病進(jìn)展[21]； 異甘草素能下調(diào)PIK3/Akt 和P38MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性, 抑制細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、 MMP-9 表達(dá), 以及乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力[22], 同時(shí)通過(guò)細(xì)胞外信號(hào)ERK 調(diào)節(jié)激酶介導(dǎo)的誘導(dǎo)抗氧化基因Nrf2 的激活, 從而起到肝臟保護(hù)作用[23], 還能通過(guò)抑制ERK1/2、 p38磷酸化來(lái)抑制MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化, 改善葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[24]。 本實(shí)驗(yàn)以不同濃度異甘草素處理HCT116 細(xì)胞后, 經(jīng)Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)JNK、 ERK1/2、 P38 磷酸化水平明顯降低,表明該成分通過(guò)抑制MAPK/ERK 信號(hào)通路激活來(lái)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、 侵襲和遷移, 并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 與Hu 等[25]報(bào)道一致。

綜上所述, 異甘草素可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、 侵襲和遷移, 誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡, 其作用機(jī)制可能與抑制JNK、 ERK1/2、 P38 磷酸化水平及MAPK/ERK 信號(hào)通路激活有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)可為尋找異甘草素防治結(jié)直腸癌的潛在藥物靶點(diǎn)提供依據(jù),但仍需后續(xù)研究作支持。