任改艷， 張步有， 黃劍林

（延安大學附屬醫(yī)院臨床藥學科， 陜西 延安716000）

炎癥是一種非常重要的基本病理過程, 通常伴隨著多種疾病的發(fā)生發(fā)展, 不僅會加重疾病進程,有時甚至會產生惡性腫瘤。 在炎癥分子機制研究中, 基于炎癥信號通路中的關鍵分子篩選抗炎藥物受到廣泛關注, 其中NF-κB 是一種多效性轉錄因子, 參與多種炎癥介質的轉錄調控, 包括前炎性細胞因子（TNF-α、 IL-6、 IL-1β 等）、 趨化因子、 免疫受體等[1-2], 在其上游信號分子中Toll 樣受體（TLRs） 在炎癥反應及相關疾病中的角色備受關注[3]。 機體或細胞在LPS 刺激下, TLRs 通過髓樣分化因子88 （MyD88） 依賴性途徑活化NF-κB,IκBα 發(fā)生磷酸化并降解, NF-κB 異源二聚體轉移到核內, 啟動炎癥靶基因的轉錄, 進而放大炎癥信號[4]。 因此, 針對性抑制NF-κB 活化及其炎癥信號通路關鍵分子的表達, 被認為是防治炎癥反應及相關疾病的有效策略。

槲皮素是多羥基黃酮類化合物, 廣泛存在于多種植物中, 目前已知有100 多種中草藥中含有該成分, 如敗醬草、 魚腥草、 旋復花、 車前子、 槐花等, 具有抗腫瘤、 抗氧化、 抗炎、 保護心血管、 降壓等多方面生物活性[5-7]。 大量研究表明, 槲皮素抑制細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK） 級聯(lián)激活[8]、 一氧化氮合酶[9]（iNOS）、 環(huán)氧合酶-2[10]（COX-2） 異常上調與NF-κB 信號通路有關, 但尚無基于TLRs/NF-κB 信號轉導途徑考察該成分抗炎活性及其機制的報道, 故本實驗研究槲皮素對LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 炎癥的保護作用,探討其可能的分子機制。

1 材料

槲皮素由廣東一方制藥有限公司提供（含有量≥98%, 編 號 P0242）。 小 鼠 巨 噬 細 胞 系RAW264.7 購自中國科學院上海細胞所； DMEM 培養(yǎng)基、 胎牛血清、 脂多糖（LPS） 購自美國Bio-Rad 公司； CCK-8 試劑盒、 Griess 試劑盒、 TRIzol regent、 DMSO、 ECL 顯影試劑盒購自南京建成生物工程研究所； 反轉錄試劑盒、 熒光定量PCR 試劑盒、 BCA 蛋白定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司； β-actin、 iNOS、 IκBα、 p-IκBα 及p-NF-κB p65抗體購自美國CST 公司； TLR4 抗體購自美國Santa Cruz 公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng), 置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中, 每2 d 換液1 次, 取對數(shù)期細胞用于實驗。

2.2 細胞活力檢測 RAW264.7 細胞懸液按照1×106/mL 的密度接種于96 孔板中, 每孔100 μL,設置空白組（培養(yǎng)基）、 對照組（細胞+培養(yǎng)基）、槲皮素組（1、 5、 15、 25、 35、 50 μmol/L）, 每組4 個復孔, 藥物干預12 h, 24 h 后棄去培養(yǎng)基,每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育1 h, 450 nm 波長處測定吸光度（A）, 計算細胞存活率, 公式為存活率=[（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）] ×100%。

2.3 NO 水平檢測 采用Griess 法。 RAW264.7 細胞懸液按照1×105/mL 的密度接種于96 孔板, 1、5、 15、 25、 35、 50 μmol/L 槲皮素預處理2 h 后,加入LPS （2 μg/mL） 共同孵育12 h, 設置空白組（培養(yǎng)基）、 對照組 （細胞+培養(yǎng)基）、 LPS 組、LPS+槲皮素組, 每組6 個復孔, 按照Griess 試劑盒操作步驟測定上清亞硝酸鹽（NO2-） 含有量。

2.4 炎癥因子mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。RAW264.7 細胞懸液按照1×106/mL 的密度接種于6 孔板中, 每孔3 mL, 同法處理、 培養(yǎng)細胞, 每組3 個復孔, 培養(yǎng)結束后TRIzol 試劑提取總RNA, 定量蛋白。 按照TaKaRa 反轉錄試劑盒操作步驟合成槲皮素, SYBR Green PCR 試劑聯(lián)合熒光定量PCR儀進行PCR 擴增和檢測, 反應條件為95 ℃預變性1 min, 95 ℃變性15 s, 60 ℃退火60 s, 共43 個循環(huán)。 再通過Primer 5.0 軟件設計引物, 并采用Blast 程序進行驗證, 涉及引物由西安西今生物科技公司合成, 見表1, 每次擴增以β-Actin 基因為內標, 對PCR 產物進行分析, 比較各組mRNA表達。

2.5 NF-κB 信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blot 法。 同法處理、 培養(yǎng)細胞, 培養(yǎng)結束后棄去上清, 預冷PBS 液洗滌, 使用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液于冰上裂解蛋白, 離心取上清, 按照BCA 試劑盒操作步驟定量蛋白, 95 ℃滅活15 min, 10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白, 濕轉100 min 后將蛋白轉移至PVDF 膜上, 5%脫脂牛奶封閉2 h, 分別用一抗iNOS、 COX-2、 TLR4、IκBα、 p-IκBα、 p-NF-κB p65、 β-actin 于4 ℃下孵育過夜。 PBST 緩沖液洗膜3 次, 每次10 min, 與二抗共孵1 h 后ECL 顯影。 以β-actin 為內標, 定量分析蛋白表達。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 18.0 軟件進行處理,數(shù)據(jù)以±s） 表示, 組間比較采用單向方差分析及LSD 檢驗。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 槲皮素對RAW264.7 細胞活力的影響 圖1顯示, RAW264.7 細胞經(jīng)0 ～50 μmol/L 槲皮素處理12、 24 h 后, 其活力無明顯變化（P＞0.05）。

圖1 槲皮素對RAW264.7 細胞活力的影響Fig.1 Effects of quercetin on RAW264.7 cell viability

3.2 槲皮素對NO 釋放及iNOS、 COX-2 蛋白表達的影響 圖2 顯示, 與對照組比較, LPS 組NO 釋放顯著升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25、 50 μmol/L） 組其釋放顯著降低（P ＜0.05）。 圖3 顯示, 與對照組比較, LPS 組iNOS、COX-2 蛋白表達顯著升高（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素組能劑量依賴性地顯著抑制兩者蛋白表達（P＜0.05, P＜0.01）。

3.3 槲皮素對炎癥因子mRNA 表達的影響 圖4顯示, 與對照組比較, LPS 組TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS、 COX-2、 MCP-1 mRNA 表達顯著上調（P＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素組六者mRNA 表達不同程度地下調, 有些差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05, P＜0.01）。

圖2 槲皮素對NO 釋放的影響Fig.2 Effects of quercetin on NO release

圖3 槲皮素對iNOS、 COX-2 蛋白表達的影響Fig.3 Effects of quercetin on iNOS and COX-2 protein expressions

3.4 槲皮素對NF-κB 信號通路相關蛋白表達的影響 圖5 顯示, 與對照組比較, LPS 組p-IκBα、 p-NF-κB p65 蛋 白 表 達 顯 著 升 高 （P ＜0.05, P ＜0.01）, IκBα 蛋白表達顯著降低（P ＜0.01）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25 μmol/L） 組前兩者蛋白表達顯著降低（P＜0.05）, 后者蛋白表達顯著升高（P＜0.05）。

3.5 槲皮素對Toll 樣受體及其信號分子表達的影響 圖4 顯示, 與對照組比較, LPS 組TLR2、TLR4、 MyD88 mRNA 表達顯著上調 （P ＜0.01）；與LPS 組比較, 槲皮組TLR2 mRNA 表達無顯著變化 （P ＞0.05）, 而 TLR4 （15、 25 μmol/L）、MyD88 （5、 25 μmol/L） mRNA 表 達 顯 著 下 調（P＜0.05, P＜0.01）。 圖5 顯示, 與對照組比較,LPS 組TLR4 蛋白表達顯著升高（P ＜0.05）； 與LPS 組比較, LPS+槲皮素（25 μmol/L） 組其蛋白表達顯著降低（P＜0.05）。

圖4 槲皮素對TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS、 COX-2、 MCP-1、 TLR2、 TLR4、 MyD88 mRNA 表達的影響Fig.4 Effects of quercetin on TNF-α， IL-6， IL-1β， iNOS， COX-2， MCP-1， TLR2， TLR4 and MyD88 mRNA expressions

圖5 槲皮素對TLR4、 IκBα、 p-IκBα、 p-NF-κB p65 蛋白表達的影響Fig.5 Effects of quercetin on TLR4， IκBα， p-IκBα and p-NF-κB p65 protein expressions

4 討論

炎癥為常見的基本病理過程, 是對刺激產生的防御性免疫反應, 各種細菌、 病毒、 內毒素等都能導致人體各組織、 器官、 細胞炎癥的發(fā)生[11]。 在炎癥反應及相關疾病發(fā)生過程中, 巨噬細胞是主要的炎癥細胞, 以LPS 誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7作為體外炎癥模型, 可誘導細胞產生多種炎性介質、 細胞因子、 趨化因子等[12], 均可促進炎癥反應, 故該模型被廣泛用于抗炎藥物篩選評價。 本實驗采用不同濃度槲皮素處理RAW264.7 細胞, 發(fā)現(xiàn)在0～50 μmol/L 時對細胞活力無明顯影響, 提示安全用藥范圍為≤50 μmol/L。

iNOS 與炎癥密切相關, 主要在炎癥及LPS 刺激下表達, 可催化L-精氨酸持續(xù)產生NO, 過量NO 將導致細胞損傷、 組織壞死, 進而促進炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展, 而且其產生能活化自身的環(huán)氧合酶COX, 其中COX-2 是誘生型表達的酶, 與炎癥性疾病關系密切, 其表達與炎癥嚴重程度有關, 各種炎癥反應中均發(fā)現(xiàn)其蛋白、 mRNA 表達升高[13]。本實驗用1、 5、 15、 25、 35、 50 μmol/L 槲皮素分別預處理RAW264.7 細胞2 h, 與LPS 共同作用后通過Griess 試劑法檢測細胞上清亞硝酸鹽含有量,Western blot 法檢測iNOS、 COX-2 表達, RT-PCR法檢測iNOS、 COX-2 mRNA 表達, 發(fā)現(xiàn)中、 高劑量組（25、 50 μmol/L） 呈濃度依賴性地抑制由LPS 誘導RAW264.7 細胞NO 的釋放, 并且不同程度地下調iNOS、 COX-2 蛋白、 mRNA 表達, 初步驗證該成分的體外炎癥保護作用。

RAW264.7 細胞表面具有天然免疫的TLRs 病原模式識別受體, 能識別外源性同源配體LPS, 后者信號分子通過TLRs 轉導至RAW264.7 細胞內, 激活轉錄因子NF-κB, 進而啟動TNF-α、 IL-1β、 IL-6、單核細胞趨化蛋白-1 （MCP-1） 等炎癥級聯(lián)效應酶mRNA 表達, 引發(fā)系列免疫炎癥反應, 后者又可誘導NF-κB 進一步活化, 形成正反饋作用, 加重炎癥反應[14-16]。 TLRs 轉導途徑主要包括MyD88 依賴性、非依賴性途徑, 前者介導大部分TLRs, 而后者僅介導TLR3, 而且TLR4 由2 種途徑共同介導[17]。 本實驗發(fā)現(xiàn), RAW264.7 細胞經(jīng)LPS 誘導后TLR2、 TLR4、MyD88 mRNA 表達顯著上調, 表明RAW264.7 細胞炎癥反應是由TLRs 識別LPS 后引起的TLRs 級聯(lián)免疫炎癥反應； 槲皮素能下調MyD88、 TLR4 mRNA 表達,但對TLR2 mRNA 表達無明顯作用； 25 μmol/L 濃度下能明顯下調LPS 誘導的RAW264.7 細胞中TLR4 蛋白表達, 表明該成分可通過下調RAW264.7 細胞TLR4蛋白、 mRNA 表達, 抑制其募集接頭分子MyD88, 進而抑制NF-κB 活化。

TNF-α、 IL-1β、 IL-6、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1） 主要是由LPS 誘導的單核巨噬細胞產生的前炎細胞因子, 是機體早期炎癥標志物, 可在損傷、 感染、 免疫反應等情況下大量分泌釋放, 為炎癥反應的促發(fā)劑[1]。 本實驗通過RT-PCR 法檢測細胞中炎性細胞因子、 趨化因子mRNA 表達, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)LPS 誘導后RAW264.7 細胞中TNF-α、 IL-1β、IL-6、 MCP-1 mRNA 表達均升高, 而槲皮素對其均有劑量依賴性的抑制作用。

NF-κB 是炎癥反應中的關鍵轉錄因子, 靜息狀態(tài)下以非活性NF-κB/IκB 復合物形式存在于細胞質中, 當細胞受到LPS 等刺激后, IκB 發(fā)生磷酸化并降解, NF-κB、 IκB 解離, 然后轉移至核內參與調節(jié)細胞因子、 趨化因子表達及炎癥反應[18]。 本實驗通過Western blot 法對NF-κB 通路相關蛋白表達進行檢測, 發(fā)現(xiàn)RAW264.7 細胞經(jīng)LPS 誘導后,細胞中p-IκB、 p-NF-κB p65 蛋白表達增加, IκB 蛋白表達減少, 而25 μmol/L 槲皮素能下調前兩者蛋白表達, 上調后者蛋白表達, 提示該成分可通過抑制IκB 磷酸化和降解, 從而減少NF-κB 核轉位。

綜上所述, 槲皮素對LPS 誘導RAW264.7 細胞炎癥有一定保護作用, 其作用機制可能與該成分參與調控TLR4/NF-κB 通路, 進而抑制細胞炎性介質（iNOS、 COX-2）、 炎性細胞因子（TNF-α、 IL-1β、 IL-6）、 趨化因子（MCP-1） 表達有關。 今后,將進一步探討槲皮素炎癥保護作用的具體分子機制, 尋找其他更有效的上游分子靶點及信號調控通路, 為相關藥理研究和藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。