肖耀華， 雷丹丹， 徐國波， 周 孟， 何 迅， 廖尚高*

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 貴州 貴安新區(qū)550025； 2. 國家苗藥工程技術(shù)中心， 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽550004）

良姜胃瘍膠囊是臨床用于治療寒凝氣滯所致胃脘疼痛、 反酸嘈雜、 胃十二指腸潰瘍癥狀的中藥復(fù)方制劑, 收載于國家藥品監(jiān)督管理局《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》 （中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分） 內(nèi)科脾胃分冊中[1], 由鐵筷子、 吳茱萸、 地烏泡、 高良姜、 藿香5 味中藥材加工而成, 方中鐵筷子具有祛風(fēng)止痛、 理氣解毒的功效, 主治胃痛和腹痛[2-4]； 吳茱萸具有鎮(zhèn)痛、 抗炎、 抗菌、 抗胃潰瘍等作用, 為常用的溫中散寒藥[5-7]。

目前, 良姜胃瘍膠囊中除地烏泡藥材以外的其他4 味中藥材已有較多質(zhì)量控制報(bào)道[8-11], 但其現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中僅對吳茱萸堿、 吳茱萸次堿進(jìn)行TLC 定性鑒別和含有量測定, 顯得較為單薄。 因此, 本實(shí)驗(yàn)通過HPLC 法同時(shí)測定良姜胃瘍膠囊中東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿的含有量, 為全面評價(jià)該制劑質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters2998 型PDA 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）； SG8200HE 型超聲波提取器（上海冠特超聲儀器有限公司）； TB-2150D 型電子天平（十萬分之一, 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； ZYCGF-Ⅱ-10T 型超純水機(jī)（四川卓越水處理設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥 東莨菪苷（批號D0401AS）、 異嗪皮啶（批號J0709AS）、 東莨菪內(nèi)酯（批號S0305AS）對照品均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司； 吳茱萸堿 （ 批 號 920C022）、 吳 茱 萸 次 堿 （ 批 號831A022）、 吳茱萸新堿（批號327A021） 對照品均購自北京索萊寶科技有限公司； 去氫吳茱萸堿（批號P24M7F11741） 對照品購自上海源葉生物科技有限公司。 良姜胃瘍膠囊（貴州宏奇藥業(yè)有限公司, 0.5 g×12 粒/板×2 板/盒, 批號20180501、20180601、 20180602）。 甲醇為色譜純（美國天地有限公司）； 甲酸為分析純（重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司）； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（150 mm×4.6 mm, 5 μm）； 流動相甲醇 （A） -0.1% 甲酸（B）, 梯度洗脫 （0 ～8 min, 10% ～21% A； 8 ～14 min, 21%A； 14 ～20 min, 21% ～29% A； 20 ～29 min, 29%A； 29 ～35 min, 29% ～55% A； 35 ～42 min, 55% ～73% A； 42 ～60 min, 73% ～100%A）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長267 nm （吳茱萸堿）、 334 nm （東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿）； 進(jìn)樣量10 μL。 在此色譜條件下, 各成分分離度＞1.5, 見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品東莨菪苷12.91 mg、 去氫吳茱萸堿8.04 mg、 東莨菪內(nèi)酯6.51 mg、 異嗪皮啶9.99 mg、 吳茱萸堿5.75 mg、吳茱萸次堿6.90 mg、 吳茱萸新堿5.00 mg, 甲醇配制 成0.516 4、 0.225 1、 0.130 2、 0.239 8、0.109 3、 0.179 4、 0.050 0 mg/mL, 搖勻, 即得,4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 供試品溶液制備 稱取同一批膠囊內(nèi)容物0.5 g, 置于平底燒瓶中, 精密加入70% 甲醇25 mL, 稱定質(zhì)量, 回流提取30 min, 冷卻至室溫, 70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量, 搖勻, 濾過, 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照膠囊處方比例及制備工藝, 分別制備缺吳茱萸、 鐵筷子的陰性樣品,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備, 即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2” 項(xiàng)下對照品溶液, 70%甲醇稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度, 各精密吸取10 μL, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）, 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸, 結(jié)果見表1, 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批供試品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次, 測得東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿峰面積RSD 分別為 0.27%、 1.17%、 1.00%、 0.28%、 1.61%、1.03%、 1.13%, 表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液, 室溫下于0、 2、 4、 8、 12、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定, 測得東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿峰面積RSD 分別為0.33%、 1.81%、 0.79%、0.57%、 0.23%、 0.25%、 0.59%, 表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊6 份, 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定, 測得東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸 新 堿 含 有 量 RSD 分 別 為 2.00%、 2.05%、2.19%、 1.71%、 2.34%、 1.49%、 2.59%, 表 明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的膠囊9 份, 每份約0.5 g, 按成分原有量加入50%、100%、 150%水平的對照品各3 份, 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定, 計(jì)算回收率。 結(jié)果, 東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿平均加樣回收率分別為102.21%、 102.34%、 102.63%、 101.73%、98.84%、 101.59%、 101.89%, RSD 分別為1.20%、2.00%、 0.95%、 0.69%、 1.05%、 0.87%、 1.37%。

2.10 樣品含有量測定 取3 批膠囊, 按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定, 外標(biāo)法計(jì)算含有量, 結(jié)果見表2。

表2 各成分含有量測定結(jié)果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 討論

3.1 檢測波長考察 本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器, 對各成分在190～400 nm 波長處進(jìn)行紫外吸收掃描, 發(fā)現(xiàn)東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿分別在226、 289、 339 nm, 248、 363 nm, 228、297、 343 nm, 333 nm, 225、 267 nm, 213、343 nm, 214、 238、 322、 334 nm 處有最大吸收峰。 再考察不同檢測波長下色譜峰數(shù)目、 豐度、 分離度, 發(fā)現(xiàn)東莨菪苷、 去氫吳茱萸堿、 東莨菪內(nèi)酯、 異嗪皮啶、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿, 以及吳茱萸堿分別在334、 267 nm 波長下基線平穩(wěn), 色譜豐度較好, 故選擇兩者作為檢測波長。

3.2 洗脫條件考察 本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水[12]、甲醇-0.1%甲酸、 乙腈-0.1%甲酸[13-15]的分離效果,發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%甲酸洗脫時(shí)色譜峰峰形、 分離度較理想, 故選擇其作為流動相。

3.3 柱溫考察 本實(shí)驗(yàn)比較了25、 30、 35 ℃下的分離效果, 發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)各成分分離度最理想, 故選擇其作為柱溫。

3.4 提取方法考察 本實(shí)驗(yàn)比較了回流、 超聲提取對提取率的影響, 發(fā)現(xiàn)前者更優(yōu)； 比較了提取溶劑（水、 50%甲醇、 70%甲醇、 甲醇） 對提取率的影響, 發(fā)現(xiàn)70% 甲醇提取時(shí)色譜峰數(shù)量更多； 比較了提取時(shí)間（30、 60、 90、 120 min） 對提取率的影響, 發(fā)現(xiàn)提取30 min 時(shí)色譜峰數(shù)量與峰面積最理想, 提取60 min 時(shí)與30 min 時(shí)相當(dāng), 而提取120 min 時(shí)色譜峰數(shù)量反而減少, 故選擇30 min作為提取時(shí)間。 綜上所述, 最佳提取方法為70% 甲醇回流提取30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測定良姜胃瘍膠囊中東莨菪苷、 異嗪皮啶、 東莨菪內(nèi)酯、 吳茱萸堿、 吳茱萸次堿、 吳茱萸新堿、 去氫吳茱萸堿的含有量,該方法簡便準(zhǔn)確, 重復(fù)性良好, 可用于該制劑的質(zhì)量控制。