袁茵 宮顥 李永文 張洪兵 李穎 李偉婷 王攀 施睿峰 劉紅雨 陳軍

肺癌是目前世界上最重要和致命的癌癥之一，其死亡病例占所有癌癥死亡人數(shù)的25%。在所有肺癌病例中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占80%-85%。NSCLC包括腺癌、鱗癌和大細胞肺癌三種主要的組織類型，其中腺癌約占40%-50%，鱗癌約占20%-30%[1-3]。只有少部分NSCLC患者在早期（I期或II期）診斷；超過60%的肺癌患者在診斷時腫瘤已出現(xiàn)侵襲或轉(zhuǎn)移性病變（III期或IV期）[2]。在過去的20年里，盡管肺癌的診斷和治療技術(shù)得到了較大的進步，但肺癌的5年生存率仍然在10%-17%之間。其原因在于，多數(shù)的患者發(fā)生了轉(zhuǎn)移。約30%的患者在初診時就有遠處轉(zhuǎn)移，50%-60%的患者在治療過程中發(fā)生轉(zhuǎn)移，80%-90%的患者最終死于轉(zhuǎn)移，因此，轉(zhuǎn)移是肺癌患者最嚴重的挑戰(zhàn)，是肺癌患者死亡的最重要原因[4]。

腫瘤的血管生成（angiogenesis）是腫瘤發(fā)展中的一個重要過程。腫瘤的生長有兩個明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，并且促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，是腫瘤生長和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可刺激內(nèi)皮細胞增殖與分化，是胚胎發(fā)生、骨骼生長期間生理性血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在近年研究中，發(fā)現(xiàn)VEGF和血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR）在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中是促進腫瘤血管生成的重要因子，VEGF可通過VEGFR2正反饋作用刺激VEGF產(chǎn)生，從而促進腫瘤血管生成，進而促進腫瘤的活性及轉(zhuǎn)移，因此，針對VEGF/VEGFR的治療成為重要的腫瘤治療方法之一[5]。

阿帕替尼（Apatinib, YN968D1）是一種新型多靶點抗腫瘤藥物，其作為VEGFR2酪氨酸激酶抑制劑，在體內(nèi)及體外均有很高的活性,可通過抑制VEGF/VEGFR2信號通路抑制血管生成[6]。最近研究[7-12]表明，Apatinib對VEGFR2酪氨酸激酶抑制性治療在胃癌、骨肉瘤、膽管癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中有效，其機制不僅抑制血管生成，還可能與抑制腫瘤細胞侵襲遷移作用有關(guān)，其可能通過的途徑為：通過STAT3抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）；抑制VEGFR2/RAF/MEK/ERK及PI3K/AKT/mTOR通路；與KIF5B-RET在腫瘤中的驅(qū)動因素相關(guān)等。 并且，Apatinib可與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼（Geftininb）聯(lián)用，在EGFR基因T790M突變的吉非替尼耐藥NSCLC細胞中，明顯增強抗腫瘤作用[13]。上述研究表明，Apatinib不但可以抑制血管生成進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還可通過多種途徑抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前，我們對該藥物在NSCLC中作用機制的了解仍然有限。本研究通過體外實驗探討Apatinib對肺腺癌細胞侵襲遷移能力的影響，并進一步探索其潛在的下游調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及主要試劑 人肺腺癌細胞系H1299（EGFR wt, N-Ras Q61K）與H3255（EGFR L858R, K-Ras wt）購自中國科學院細胞庫（中國上海），阿帕替尼(S7297，Apatinib) 購自Selleck公司，抗體： VEGF、VEGFR 2抗體購自Abcam公司，MMP9、MMP2抗體購自Santa Cruz公司，E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司。胰蛋白酶、CCK-8均購自Bioind公司。Tranwell購自美國Corning公司。二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide, DMSO）購自碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，待細胞融合度達至90%左右，用0.25%胰酶-EDTA（ethylenediaminetetracetic acid）消化傳代，所有實驗均采用對數(shù)生長期細胞。

1.3 CCK 8 法測定細胞活性 收集 H1299與H3255呈對數(shù)期穩(wěn)定生長的細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至2.5×104/mL，向96孔板中每孔加入200 μL懸液，5%CO2，37 ℃培養(yǎng)過夜，待細胞貼壁后，各組加入濃度為0 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L、64 μmol/L、128 μmol/L梯度遞增的Apatinib 200 μL，每個濃度設(shè)4個復孔，5%CO237 ℃孵育24 h后，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK-8及90 μL完全培養(yǎng)基，染色1 h；多功能酶標儀以O(shè)D 450nm處測量各孔吸光值；計算細胞抑制率及IC50。

1.4 劃痕實驗 將H1299與H3255細胞接種至6孔板中，加入完全培養(yǎng)基，待細胞匯合率為85%-95%時，用200 μL黃色槍尖劃痕，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗3次，將各孔分為對照組（NC）與不同濃度加藥組，H1299細胞各組每孔分別加入0 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L Apatinib 2mL，H3255細胞中各組每孔分別加入0 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L Apatinib 2 mL于0 h、12 h、24 h時置于倒置顯微鏡下觀察拍照。細胞遷移率=100%×（0 h劃痕寬度-12 h或24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度。每個實驗獨立重復3次，取平均值。

1.5 侵襲實驗 準備Transwell及24孔板。按照1:10比例稀釋基質(zhì)膠并加入20 μL 至Transwell小室上室，置于37 ℃溫箱凝固4 h。收集加入完全培養(yǎng)基與加入Apatinib 8 μmol/L培養(yǎng)24 h的H1299與H3255細胞，分為對照組（NC）與加藥組，使用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，取 200 μL加入上室，將500 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基加入下室，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽輕柔擦去上室面細胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌3遍。將小室置于倒置顯微鏡下觀察，每個樣本隨機選取5個視野計數(shù)。每個實驗獨立重復3次，取平均值。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印記實驗 將H1299與H3255細胞接種至6孔板中，待細胞匯合率為70%-80%時加入不同濃度Apatinib，24 h后提取蛋白。BCA法測蛋白濃度。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，充分混勻，100 ℃金屬浴變性15 min。每種樣品取30 μg蛋白上樣電泳，采用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，含5%脫脂牛奶的TBST搖床上室溫封閉2 h。將PVDF膜按照不同分子量切開，加入對應的抗體，4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBST室溫漂洗3次，每次5 min，加HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，顯色曝光，分析條帶吸光值。

1.7 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0版軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 5.01版軟件處理數(shù)據(jù)分析作圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，實驗中組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Apatinib能抑制肺癌細胞H1299與H3255的活性 如圖1所示，在H1299與H3255細胞中，經(jīng)過不同濃度的Apatinib處理24 h后，Apatinib的IC50分別為（32.67±3.12）μmol/L和（14.44±1.92）μmol/L，而且兩個細胞的活性隨著Apatinib藥物濃度的升高而呈明顯下降趨勢，提示Apatinib能夠明顯抑制肺腺癌細胞H1299與H3255的活性。

2.2 Apatinib能抑制肺癌細胞H1299與H3255的遷移和侵襲能力 為了研究Apatinib對肺癌細胞H1299與H3255的遷移和侵襲能力的作用，我們分別用不同濃度Apatinib處理H1299與H3255細胞，通過劃痕實驗分別在12 h和24 h節(jié)點檢測Apatinib對細胞遷移能力的影響。如圖2A、圖2C所示， 在H1299細胞中，與對照組（NC）相比，12 h時8 μmol/L Apatinib對細胞的遷移能力有一定的抑制作用，但無統(tǒng)計學意義；而16 μmol/L Apatinib對細胞的遷移能力則有明顯的抑制作用（P＜0.05）；24 h時8 μmol/L與16 μmol/L Apatinib對細胞的遷移能力均有明顯的抑制作用，且藥物高濃度抑制作用比低濃度更加明顯（P＜0.05）。如圖2B、圖2D所示，在H3255細胞中，與對照組（NC）相比，12 h與24 h時4 μmol/L與8 μmol/L Apatinib對細胞的遷移能力均有明顯的抑制，而且藥物高濃度的抑制作用比低濃度更明顯（P＜0.05）。這些結(jié)果表明Apatinib具有抑制肺腺癌細胞遷移的能力。

進一步通過Transwell小室檢測Apatinib對肺癌細胞H1299與H3255侵襲能力的影響。如圖3所示，H1299細胞中，每視野細胞數(shù)對照組（NC）為（220.7±18.49），Apatinib處理組為（101.0±22.52）；H3255細胞中，每視野細胞數(shù)對照組（NC）為（149.3±14.72），Apatinib處理組為（67.00±23.96）。與對照組相比，H1299與H3255細胞中Apatinib處理組穿過基質(zhì)膠的細胞均顯著減少（P＜0.05）。這些結(jié)果表明Apatinib能夠抑制肺腺癌細胞H1299與H3255的侵襲。

圖1 Apatinib抑制肺癌細胞增殖。不同濃度的Apatinib處理肺癌細胞H1299與H3255 24 h后，肺癌細胞的活性隨藥物濃度梯度的增加而明顯降低。 其中，H1299的 IC50為（32.67±3.12）μmol/L，H3255的 IC50為（14.44±1.92）μmol/L。Fig 1 Apatinib inhibits lung cancer cell proliferation.After treatment with different concentrations of Apatinib for 24 h in lung cancer cells H1299 and H3255, the viability of lung cancer cells were decreased significantly with the increase of drug concentration gradient.The IC50 of H1299 is (32.67±3.12) μmol/L, and the IC50 of H3255 is (14.44±1.92)μmol/L.

圖2 Apatinib抑制肺癌細胞遷移。A、C：H1299細胞劃痕實驗；B、D：H3255細胞劃痕實驗。經(jīng)低濃度Apatinib（Apa low）與高濃度Apatinib（Apa high）處理24 h后，H1299與H3255細胞的劃痕愈合度與對照組（NC）相比均顯著降低，并且隨著Apatinib的藥物濃度增加，抑制作用增強。Fig 2 Apatinib inhibits lung cancer cell migration.A, C: H1299 cell scratch test; B, D: H3255 cell scratch test.After treated with different concentrations of Apatinib (Apa) for 24 h, the scratch healing degree of H1299 and H3255 cells was significantly lower than that of the control group, and the inhibitory effect was enhanced with the increase of drug concentration of Apatinib.

圖3 Apatinib抑制肺癌細胞侵襲能力。A,B：Transwell小室檢測細胞侵襲能力，與對照組（NC）相比，Apatinib（Apa）處理后的穿過小室的H1299與H3255細胞數(shù)目明顯減少。Fig 3 Apatinib inhibits the invasive ability of lung cancer cells of H1299 and H3255.A-B: Compared with the control group, the number of cells that passed through the transwell after Apatinib (Apa) treatment was significantly reduced.

2.3 Apatinib抑制VEGF/VEGFR2和調(diào)控EMT及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達 如圖4A-圖4C所示，經(jīng)不同濃度Apatinib處理H1299與H3255細胞24 h后，通過Western blot檢測蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度增加，VEGF、VEGFR2、N-cadherin、MMP9、MMP2、Vimentin表達下調(diào)，E-cadherin表達上調(diào)。提示Apatinib通過抑制VEGF/VEGFR2和調(diào)控EMT及基質(zhì)金屬蛋白酶等相關(guān)蛋白的表達，進而可能抑制細胞的遷移及侵襲。

圖4 Apatinib處理不同肺癌細胞株后相關(guān)蛋白的變化情況。經(jīng)不同濃度Apatinib處理H1299和H3255細胞24 h后，通過Western blot檢測不同蛋白表達情況，其中，GAPDH為內(nèi)對照。A：Apatinib抑制VEGF/VEGFR2蛋白的表達；B：Apatinib調(diào)節(jié)EMT蛋白的變化。隨藥物濃度增加，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，而N-cadherin、Vimentin蛋白表達下調(diào)；C：Apatinib調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的變化。隨藥物濃度增加，MMP9、MMP2蛋白表達下調(diào)。Fig 4 Alter the expression of the proteins after Apatinib treatment in different lung cancer cell lines.After treatment of H1299 and H3255 cells with different concentrations of Apatinib for 24 hours, the expression of different proteins was detected by Western blot, wherein GAPDH was an internal control.A: Apatinib inhibits the expression of VEGF/VEGFR2 protein; B: Apatinib regulates the expression of EMT proteins.The expression of E-cadherin protein was increased with the increasing of drug concentration of Apatinib, while the expression of N-cadherin and Vimentin protein was decreased; C: Apatinib regulates the expression of matrix metalloproteinases.The expression of MMP9 and MMP2 proteins was decreased with the increasing of drug concentration of Apatinib.

3 討論

目前，全球每年約有180萬人確診為肺癌，160萬人死于肺癌。肺癌患者的5年生存率從4%-17%不等，取決于臨床分期和地域差異[14]。傳統(tǒng)治療方式為手術(shù)、放療及化療，近年新型的治療方式以靶向治療及免疫治療為主，如針對EGFR突變采用Gefitinib、Osimertinib等靶向藥物，提高了部分患者的生存時間，但長期使用靶向藥物的同時腫瘤細胞耐藥性隨之產(chǎn)生，因此有待研發(fā)特異性靶向作用的下一代藥物和更多特異性突變位點的靶向藥物。相關(guān)藥物如細胞周期抑制劑、血管生成抑制劑如PD0332991、Apatinib等與靶向藥物的聯(lián)用也越來越多的進行了探索[2,13,15]。而對于Apatinib的研究開始于胃癌方面，進而證實可抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移，但對肺癌細胞的相關(guān)作用報道尚少。所以，對于肺癌細胞及藥物作用機制的研究仍然具有十分重要的意義。

VEGF通過自身與其受體功能對血管生成起重要作用，并且在體內(nèi)及體外都是內(nèi)皮細胞的存活因子，可通過PI3K-AKT途徑減少細胞凋亡，同時誘導抗凋亡蛋白Bcl-2和A1的表達。還可以通過癌細胞本身存在的直接結(jié)合的VEGFR來調(diào)節(jié)腫瘤生長，包括多種實體腫瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤。VEGF和VEGFR的過度表達與腫瘤生長速度、微血管密度、增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移潛能及各種惡性腫瘤患者預后不良有關(guān)。目前，針對VEGF及其受體的靶向藥物研究正在進行。抗血管生成類藥物如索拉非尼、蘇尼替尼和帕唑帕尼在腎細胞癌、結(jié)腸癌等腫瘤治療中取得成效。Apatinib是多靶點抗腫瘤藥物，其主要功能為針對VEGFR酪氨酸激酶的產(chǎn)生抑制性，其結(jié)合親和力是索拉非尼（Sorafenib）的10倍。Apatinib可在細胞中有效抑制VEGFR2、c-kit和c-src的激酶活性，并抑制VEGFR2、c-kit和PDGFRβ的磷酸化，進而可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖及遷移。在體內(nèi)實驗中，Apatinib可以阻斷大鼠主動脈環(huán)的形成，這是對其抗血管生成活性的更好驗證[5,6]。而臨床中其靶向藥物實驗也在開展。Li等[11]將144例轉(zhuǎn)移性胃癌且至少兩種化學治療方失敗的患者納入研究，患者被隨機分配接受安慰劑（A組），Apatinib 850 mg每日一次（B組）或Apatinib 425 mg每日兩次（C組）。結(jié)果顯示Apatinib組與安慰劑組的中位生存時間顯著延長，Apatinib已被證明是沒有化療適應癥的晚期胃癌患者的唯一有效藥物。隨后，Apatinib在幾項臨床試驗[16-18]中顯示出對乳腺癌及NSCLC具有良好治療效果。證明Apatinib可以對多種腫瘤產(chǎn)生抑制作用，延長患者生存期。

本實驗結(jié)果顯示Apatinib可抑制肺腺癌細胞H1299與H3255的增殖及侵襲遷移能力，并且其作用呈藥物濃度依賴性，其作用機制可能與VEGF/VEGFR2、N-cadherin、MMP9、MMP2、Vimentin及E-cadherin有關(guān)。相關(guān)基礎(chǔ)實驗表明，Apatinib抑制VEGF-VEGFR2-PI3KAKT信號傳導，誘導人類肝內(nèi)膽管癌細胞（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）凋亡，并且最近數(shù)據(jù)[19]表明腫瘤細胞中的自分泌VEGF信號傳導在促進其增殖和抑制細胞凋亡中起重要作用。而在膽管癌細胞中，Apatinib能抑制VEGFR2/RAF/MEK/ERK及PI3K/AKT/mTOR通路，降低轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白如Slug、Snail和MMP9的表達，顯著抑制VEGF介導的細胞遷移和侵襲[8]。并且，Apatinib可通過抑制VEGFR2/ERK通路促進食管癌、膀胱癌及肺癌細胞凋亡[20-22]。另外，Apatinib可在肺腺癌細胞A549中對KIF5B-RET驅(qū)動的腫瘤治療中相關(guān)的遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用[12]。關(guān)于Apatinib的作用機制，Zheng等[7]在對骨肉瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Apatinib在體外和體內(nèi)通過STAT3抑制EMT和PD-L1，同時下調(diào)N-cadherin、MMP9、MMP2、Vimentin及上調(diào)E-cadherin的表達，進而明顯抑制癌細胞的轉(zhuǎn)移且無明顯細胞毒性，對本實驗研究方向給予提示。本研究表明，Apatinib抑制VEGF及VEGFR，并且通過誘導EMT相關(guān)信號蛋白： 上調(diào)E-cadherin、下調(diào)N-cadherin維持細胞間緊密連接，下調(diào)Vimentin修復細胞骨架，調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制細胞侵襲遷移能力，并與金屬蛋白酶MMP9、MMP2表達量下調(diào)相關(guān)。