黃澤凱 李少雷 馬媛媛 吳楠 楊躍

肺癌是全球發(fā)病率最高的癌癥類型，并且是癌癥死亡的主要原因。據(jù)估計(jì)2018年全球?qū)⒂?10萬(wàn)新發(fā)肺癌病例和180萬(wàn)新發(fā)死亡病例，死亡人數(shù)占癌癥總體死亡人數(shù)的18.4%[1]。在中國(guó)，肺癌也是最常見(jiàn)的癌癥類型和癌癥死亡的主要原因。目前最新的文獻(xiàn)顯示2015年中國(guó)新發(fā)肺癌病例為73.3萬(wàn)例，肺癌死亡病例為61.0萬(wàn)例[2]。肺腺癌是最常見(jiàn)的肺癌亞型，也是非吸煙肺癌患者中最常見(jiàn)的肺癌組織學(xué)類型[3]。盡管近些年來(lái)由于靶向治療等新的治療方式的飛速發(fā)展使得肺癌的治療取得重大進(jìn)展，但是由于約70%的患者在診斷為肺癌時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或?yàn)榫植客砥?，肺癌在美?guó)的總體生存率仍只有18%左右[4]。因此，尋找新的肺癌治療靶標(biāo)和預(yù)后生物標(biāo)志物顯得尤為重要。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一類含有約22個(gè)核苷酸的單鏈小非編碼RNA，其通過(guò)介導(dǎo)翻譯抑制或促進(jìn)靶mRNA的降解而作為內(nèi)源基因調(diào)節(jié)劑發(fā)揮重要作用[5]。據(jù)估計(jì)微小RNA可以靶向超過(guò)30%的人類基因組，而且微小RNA的異常表達(dá)已經(jīng)被證實(shí)與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[6]。MiR-148b-3p作為一種重要的微小RNA，已經(jīng)被報(bào)道與腎癌、胃癌、乳腺癌等多種癌癥密切相關(guān)，但與肺腺癌的關(guān)系尚不清楚[7-9]。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-148b-3p在肺腺癌中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及臨床資料 收集2011年1月-2012年12月之間在我科進(jìn)行手術(shù)切除的肺腺癌患者的腫瘤標(biāo)本123例。納入本研究的患者均為初診且術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療，排除伴其他惡性腫瘤或有既往惡性腫瘤病史的患者。本項(xiàng)研究通過(guò)了本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者的知情同意。在123例肺腺癌患者中男性73例，女性50例。年齡范圍為31歲-86歲，其中≥60歲56例，＜60歲67例。腫瘤分化程度為中高分化（G1-2）的腫瘤標(biāo)本75例，低分化（G3-4）48例。腫瘤大小≥3 cm 63例，＜3 cm 60例。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（node status positive）63例，不存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（node status negative）60例。存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（metastasis status positive）11例，不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（metastasis status negative）112例。未接受術(shù)后治療56例；而接收術(shù)后治療67例（其中接收單純化療46例，接收單純放療1例，接收單純靶向治療5例；同時(shí)接收放化療10例，同時(shí)接收放化療和靶向治療2例，同時(shí)接收化療和靶向治療2例，同時(shí)接收放療和靶向治療1例）。

1.2 MiR-148b-3p表達(dá)量的測(cè)定及分組 病理組織保存于-80 ℃冰箱中，按照Trizol試劑（Invitrogen, Carlsbad, CA,USA）說(shuō)明書的方法提取肺腺癌腫瘤組織的總RNA，并使用NanoDrop機(jī)器進(jìn)行RNA定量與質(zhì)檢。本研究使用加尾法逆轉(zhuǎn)錄microRNA為cDNA。首先使用polyA聚合酶（New England Biolabs, USA）將polyA尾添加到0.5 μg總RNA中，然后使用M-MLV cDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Cat No.C28025032, Invitrogen）將microRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-148b-3p的表達(dá)量，并以U6為內(nèi)參基因，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用的miR-148b-3p上游引物為：5’-TCAGTGCATCACAGAACTTTGT-3’，下游引物為：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3’。U6的上游引物為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。此外，根據(jù)miR-148b-3p的相對(duì)表達(dá)量，借助Cutoff Finder程序[10]確定MiR-148b-3p分組的最佳分界值，該程序可基于對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)（Log-ranktest）計(jì)算最佳分界值。

1.3 隨訪 通過(guò)電話、郵件、復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，末次隨訪時(shí)間為2018年7月12日。在術(shù)后的前兩年，患者每3個(gè)月隨訪一次；術(shù)后3年-5年每6個(gè)月隨訪一次；術(shù)后5年以后，每年隨訪一次。對(duì)有癥狀的患者給予相應(yīng)的檢查。在隨訪期間，常規(guī)的復(fù)查項(xiàng)目包括詳細(xì)的病史詢問(wèn)、體格檢查、胸部CT檢查等?；颊咝g(shù)后的不良反應(yīng)、疾病復(fù)發(fā)、死亡等都被詳細(xì)記錄。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS version 24（Chicago, USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法對(duì)兩組計(jì)數(shù)資料進(jìn)行比較?？偵嫫冢╫verall survival, OS）定義為患者從接受手術(shù)到死亡或末次隨訪的時(shí)間，采用Kaplan-Meier生存分析方法進(jìn)行估計(jì)并且采用Log-rank檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。利用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型納入的變量為單因素Cox分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.100）的變量。

2 結(jié)果

2.1 MiR-148b-3p的相對(duì)表達(dá)量與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性 根據(jù)miR-148b-3p的相對(duì)表達(dá)量，借助Cutoff Finder程序[10]將123例肺腺癌患者分為71例miR-148b-3p高表達(dá)組和52例miR-148b-3p低表達(dá)組。MiR-148b-3p表達(dá)量與腫瘤的分化程度（P=0.001）、腫瘤大小（P=0.007）顯著相關(guān)，而與年齡、性別、吸煙史、飲酒史、脈管癌栓、胸膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的相關(guān)性，見(jiàn)表1。

2.2 MiR-148b-3p表達(dá)量與肺腺癌患者總生存之間關(guān)系的Kaplan-Meier生存分析 所有患者的中位隨訪時(shí)間是68.0個(gè)月（95%CI： 62.9-73.1）。MiR-148b-3p高表達(dá)組的中位總生存期未達(dá)到，其1年、3年、5年的估計(jì)總生存率分別是97.2%、79.8%、69.4%。而miR-148b-3p低表達(dá)組的中位總生存期是51.0個(gè)月（95%CI： 36.7-65.3），其1年、3年、5年的估計(jì)總生存率分別是92.3%、67.3%、43.1%。Kaplan-Meier生存曲線圖分析顯示miR-148b-3p高表達(dá)組患者的總生存時(shí)間顯著優(yōu)于低表達(dá)組患者（P=0.010），見(jiàn)圖1。

2.3 肺腺癌患者總生存的單因素和多因素分析 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示腫瘤大?。≒=0.032）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）和miR-148b-3p表達(dá)量（P=0.047）是影響肺腺癌患者總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，見(jiàn)表2。

3 討論

在美國(guó)，癌癥的總體5年相對(duì)存活率超過(guò)60%，而肺癌的5年相對(duì)存活率只有18%左右[4]。當(dāng)腫瘤局限于肺部且只在局部淋巴結(jié)擴(kuò)散的時(shí)候，最有效的治療方法是手術(shù)。但是大多數(shù)肺癌患者在初次診斷時(shí)就已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或被為局部晚期，并不符合手術(shù)切除的條件，這是肺癌總體預(yù)后不良的一個(gè)重要原因[11]。因此，關(guān)于尋找新的肺癌治療靶標(biāo)或預(yù)后生物標(biāo)志物的研究，對(duì)于提高肺癌患者總體生存率和改善其預(yù)后，將具有十分重要的意義。

微小RNA（miRNA）是一類非編碼RNA分子，通過(guò)與互補(bǔ)靶mRNA結(jié)合導(dǎo)致mRNA翻譯抑制或降解，在細(xì)胞分化、增殖和存活中發(fā)揮重要作用[12]。在1993年，第一個(gè)微小RNA在秀麗隱桿線蟲上被發(fā)現(xiàn)[13]。7年后，第一個(gè)哺乳動(dòng)物微小RNA，即let-7，也被發(fā)現(xiàn)[14]。這兩個(gè)關(guān)鍵事件導(dǎo)致了之后的一系列基因組研究，揭示了許多miRNA和其他非編碼RNA的廣泛轉(zhuǎn)錄[15]。近些年來(lái)，微小RNA已成為癌癥研究的一個(gè)熱點(diǎn)。許多研究報(bào)道微小RNA可以通過(guò)控制其靶mRNA的表達(dá)以促進(jìn)或抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、血管生成等，證明了微小RNA在癌癥生物學(xué)中發(fā)揮著重要的功能[16]。此外，據(jù)報(bào)道腫瘤的微小RNA表達(dá)譜可以用來(lái)定義相關(guān)的亞型，預(yù)測(cè)患者存活率和治療反應(yīng)[6]。同時(shí)，由于微小RNA在臨床樣本中的有著比mRNA更高的穩(wěn)定性，因此比mRNA更加適合作為預(yù)后指標(biāo)[17]。

表1 miR-148b-3p的表達(dá)量與肺腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Tab 1 Correlation between expression level of miR-148b-3p and clinicopathological features of patients with lung adenocarcinoma

表2 肺腺癌患者總生存的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Tab 2 Univariate and multivariate Cox proportional hazard models analysis of overall survival of patients with lung adenocarcinoma

圖1 miR-148b-3p表達(dá)量與肺腺癌患者總生存的Kaplan-Meier生存曲線分析圖Fig 1 Kaplan-Meier survival analysis between miR-148b-3p expression level and overall survival of patients with lung adenocarcinoma

MiR-148b-3p作為一種重要的miRNA，已經(jīng)被報(bào)道與多種癌癥密切相關(guān)。Zhang等[7]基于GEO分析，發(fā)現(xiàn)腎癌中miR-148b-3p的表達(dá)降低，并且通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)證明了miR-148b-3p可以通過(guò)調(diào)節(jié)FGF2-FGFR2信號(hào)通路，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤生長(zhǎng)。Li及其同事[9]發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p的表達(dá)與中的胃癌Dock6（一種非典型Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并通過(guò)抑制Dock6/Rac1/Cdc42軸降低胃癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，從而抑制胃癌轉(zhuǎn)移。同時(shí)，miR-148b-3p高表達(dá)組的胃癌患者的預(yù)后顯著優(yōu)于低表達(dá)組的患者。然而，目前miR-148b-3p在肺癌中的作用仍不清楚。

在本研究中，我們收集了2011年1月-2012年12月之間在我科進(jìn)行手術(shù)切除的肺腺癌腫瘤標(biāo)本123例。我們發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p在肺腺癌腫瘤組織中的表達(dá)量與腫瘤分化程度（P=0.001）、腫瘤大?。≒=0.007）顯著相關(guān)。我們通過(guò)單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析發(fā)現(xiàn)，年齡（P=0.036）、腫瘤分化程度（P=0.042）、脈管癌栓（P=0.052）、腫瘤大?。≒=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.004）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.062）、術(shù)后治療（P=0.032）和miR-148b-3p表達(dá)水平（P=0.012）與患者的總生存相關(guān)。進(jìn)一步將這些變量納入多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p表達(dá)量（P=0.047）、腫瘤大?。≒=0.032）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）是影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，Kaplan-Meier生存分析顯示miR-148b-3p高表達(dá)組患者的總生存顯著優(yōu)于miR-148b-3p低表達(dá)組患者（P=0.010），表明miR-148b-3p在肺腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。但是，miR-148b-3p在肺腺癌中具體的生物學(xué)作用和機(jī)制尚不清楚，亟需進(jìn)一步闡明。如果miR-148b-3p的生物學(xué)作用能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步驗(yàn)證，那么其將有助于肺腺癌的檢測(cè)與治療。本研究由于是回顧性分析，且樣本量較少（123例），無(wú)法充分控制混雜因素的影響，尚不足以指導(dǎo)臨床實(shí)踐，但卻為后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)研究提供了有意義的參考。

綜上所述，miR-148b-3p表達(dá)量與肺腺癌的腫瘤分化程度、腫瘤大小顯著相關(guān)，是影響患者總生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。同時(shí)，miR-148b-3p高表達(dá)組患者的總生存顯著優(yōu)于miR-148b-3p低表達(dá)組患者。因此，miR-148b-3p可能在肺腺癌中扮演了非常重要的角色，有望成為新的肺腺癌治療靶標(biāo)或預(yù)后生物標(biāo)志物。