編譯 凌寒

CRISPR可能是首個有望顛覆天然基因組、消除遺傳疾病的基因編輯成果。但從一開始，就有一道難題擺在面前：準(zhǔn)確性。

早在2017年，一份報告因使用CRISPR技術(shù)而充滿爭議：因為在小鼠身上發(fā)現(xiàn)了大量脫靶的編輯，基因編輯工具肆意地剪切了無辜的基因。這項研究遭到了強(qiáng)烈的駁斥，并最終被撤回，但人們對這種強(qiáng)大工具的脫靶問題的擔(dān)憂并沒有消失。即使相對準(zhǔn)確的CRISPR替代版本，最近也因為其在DNA和RNA中引起數(shù)百個意想不到的突變而飽受爭議。

如果不能確保精準(zhǔn)性，任何已提出的CRISPR基因治療都將淪為“擲骰子”行為。

現(xiàn)在，來自杜克大學(xué)的一個團(tuán)隊可能已經(jīng)開發(fā)了一個通用的解決方案：能從根本上提高幾乎所有形式的CRISPR準(zhǔn)確性——微調(diào)了向?qū)NA。向?qū)NA是CRISPR兩個組成中不可或缺的組分，發(fā)揮著類似“偵探獵犬”的作用，它能在其合作伙伴Cas對特定DNA序列進(jìn)行切割前瞄準(zhǔn)好待修改的序列。該項研究于近期發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》雜志上。

如何微調(diào)？將一種“鎖定”結(jié)構(gòu)標(biāo)記到向?qū)NA的一端，這樣只有靶標(biāo)DNA才能激活Cas施展“剪刀”功能。然而，正是因為這個微調(diào)如此簡單，向?qū)NA 2.0可以從根本上提高多個CRISPR系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，甚至高達(dá)200倍。這樣的微調(diào)，不僅對那些依賴經(jīng)典Cas9的系統(tǒng)有效，同樣也對依賴Cas12a及其他新型剪切系統(tǒng)有效。

這并不是增量調(diào)整。相反，這一調(diào)整策略與以往為提高CRISPR準(zhǔn)確度所作的努力截然不同，以往常致力于尋找新的、更好版本的Cas剪刀。

“我們所關(guān)注的解決方案，它不會增加更多的部件，而且能夠適用于任何一種CRISPR系統(tǒng)?！毖芯繄蟾娴淖髡叨盘m·寇卡科（Dewran Kocak）說。

“這是一個相當(dāng)不錯的、簡潔的、可以杜絕脫靶現(xiàn)象的解決方案?！钡谝蛔髡卟闋査埂じ袼拱秃眨–harles Gersbach）博士補(bǔ)充說。

你好，我是向?qū)NA

為什么改變分子偵探獵犬能從根本上提高CRISPR編輯的準(zhǔn)確性？

回溯歷史，RNA結(jié)構(gòu)的變化所發(fā)揮的作用不容忽視。例如，榮獲了諾貝爾獎的基因沉默技術(shù)（RNAi）花了數(shù)十年時間才得以揭示，對靶向RNA的微小調(diào)整可以大幅度減弱免疫應(yīng)答或提高效率和準(zhǔn)確性。

RNAi等來之不易的經(jīng)驗教訓(xùn)啟發(fā)著基因編輯。當(dāng)我們在描述CRISPR的過程時，通常都是這么說的：向?qū)NA——長得像一條蠕蟲似的——包含與靶標(biāo)DNA匹配的字母序列。當(dāng)這二者結(jié)合時，會遵循嚴(yán)格的配對規(guī)則，即A與T*結(jié)合，C與G結(jié)合，之后向?qū)NA將Cas剪刀拖過來，在預(yù)定的位置進(jìn)行DNA剪切。（*更準(zhǔn)確地說， DNA中是“T”， RNA中是“U”。）

不幸的是，在生物學(xué)中，理論往往與現(xiàn)實不符。事實上，向?qū)NA看起來就像很多片被串在一起的三葉草葉子，里面塞滿了被稱之為“莖環(huán)結(jié)構(gòu)”（stem-loops）的突起，這使得它的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合效率最大化?？偟膩碚f，大多數(shù)向?qū)NA只包含20個左右的堿基。在人類浩如煙海約60億個DNA堿基中，錯配率相當(dāng)高。

這就是為什么設(shè)計向?qū)NA既是一門科學(xué)也是一門藝術(shù)的部分原因。與尤達(dá)的著名格言“要么做要么不做，沒有嘗試這一說”不同，科學(xué)家們通常需要反復(fù)修改他們設(shè)計的特定向?qū)NA序列，才能使其正常工作。

盡管如此，CRISPR一直都有一本向?qū)NA工程設(shè)計指南——一種通用的原型設(shè)計，可適用于大多數(shù)的CRISPR應(yīng)用程序。

一切都與能量有關(guān)

研究小組的靈感來自于細(xì)胞需要能量。

正如任何其他生物事件一樣，向?qū)NA與DNA結(jié)合并釋放Cas是需要能量的。之前的研究發(fā)現(xiàn)，向?qū)NA與DNA匹配得越精確，兩者就越容易形成所謂的“R環(huán)”（一種啟動了整個切割程序的分子雜交體）。

該團(tuán)隊的絕妙想法是在向?qū)NA的尾端添加一個額外的三葉草狀結(jié)構(gòu)。這種“發(fā)夾結(jié)構(gòu)”（hairpin）在很多情況下就像一個實體塊，除非向?qū)NA與靶標(biāo)DNA匹配，否則它龐大的結(jié)構(gòu)就會阻止RNA與DNA配對形成R環(huán)。無法形成R環(huán)，就不會發(fā)生切割，就能保證非靶標(biāo)DNA序列的安全。但是，如果序列確實匹配的話，向?qū)NA就會與其相匹配的DNA形成R環(huán)，撕開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這反過來會激發(fā)Cas剪刀行動。

該團(tuán)隊在計算機(jī)模擬技術(shù)的指導(dǎo)下，設(shè)計了一系列的攜帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的向?qū)NA或稱“hp-sgRNAs”，在人類細(xì)胞中進(jìn)行了試驗。當(dāng)與經(jīng)典的Cas9配對時，新型分子偵探獵犬的靶標(biāo)特異性提升了大約50倍。在一項觀察細(xì)胞基因組中脫靶效應(yīng)的敏感實驗中，研究小組發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典的向?qū)NA相比，他們的升級版本減少了124個脫靶位點，且沒有產(chǎn)生任何新的脫靶位點。

與它結(jié)合的Cas剪刀的效用一樣令人印象深刻，其中許多剪刀在結(jié)構(gòu)和功能上與Cas9僅有微弱的相似之處。然而，當(dāng)攜帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)的向?qū)NA與Cas組合后，Cas12及其變體能夠切割指定的DNA序列，其效率與和普通向?qū)NA組合時不相上下，但脫靶的情況要少得多。

此外，研究小組還發(fā)現(xiàn)，他們能夠通過微調(diào)發(fā)夾的結(jié)構(gòu)來微調(diào)Cas剪刀的效能。一個“更緊湊”的發(fā)夾能夠使得鎖定更加牢固，這雖然會降低編輯效率，但也大大提高了準(zhǔn)確性。一個“寬松的”發(fā)夾結(jié)構(gòu)有助于保持Cas的活性，但對準(zhǔn)確性卻沒有什么幫助。

“通過觀察R環(huán)的形成，我們能夠預(yù)測發(fā)夾向?qū)NA的能量情況?！闭撐淖髡呓忉尩?。這種可預(yù)測性非常有價值——它能讓未來的科學(xué)家更簡易地校正發(fā)夾向?qū)NA和CRISPR系統(tǒng)的強(qiáng)度與準(zhǔn)確性。

指南改變

這并不是科學(xué)家們第一次嘗試提高CRISPR的準(zhǔn)確性。

之前的一個想法是使CRISPR系統(tǒng)變成“鐵三角”：一個向?qū)NA加兩個Cas剪刀。要進(jìn)行DNA切割，兩個Cas必須都與相同的DNA序列相結(jié)合。雖然這是一個很巧妙的方法，但這個想法需要科學(xué)家們向細(xì)胞中輸入更多的成分，從而給本已很敏感的生態(tài)系統(tǒng)增加更多的不確定性。

另一個想法就是瓦解Cas剪刀，使他們不太可能亂剪，當(dāng)然這個想法也有其軟肋。設(shè)計特定性質(zhì)的蛋白質(zhì)是極其困難和耗時的，科學(xué)家必須根據(jù)他們的需要定制每個Cas變體。

格斯巴赫解釋說：“每次我們發(fā)現(xiàn)一種新的CRISPR蛋白，都要進(jìn)行大規(guī)模的重新改造，使其更加精確，因此這并不是一個簡易的解決方案。”

相比之下，杜克大學(xué)研究小組對向?qū)NA的探索，可能會從根本上改變今后CRISPR系統(tǒng)的設(shè)計。

“所有CRISPR系統(tǒng)都有向?qū)NA，這些短RNA更容易設(shè)計。” 寇卡科說道。

接下來，研究小組想進(jìn)一步確認(rèn)他們的發(fā)夾向?qū)NA替代品可以與其他已經(jīng)在使用的Cas剪刀協(xié)同工作。他們還想要深入研究這種合作關(guān)系是如何運作的，并探索進(jìn)一步提高靶向準(zhǔn)確性的方法——不僅是在自由漂浮的細(xì)胞中，更重要的是，在患有遺傳疾病的動物模型中。