陳繁，劉翠玲*，陳蘭珍，孫曉榮，李熠，金玥

1(北京工商大學(xué) 計(jì)算機(jī)與信息工程學(xué)院，北京，100048) 2(北京工商大學(xué),食品安全大數(shù)據(jù)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100048) 3(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蜜蜂研究所農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京，100093)

蜂王漿是由工蜂舌腺和上顎腺分泌的一種乳漿狀物質(zhì)，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有水分、蛋白質(zhì)、氨基酸和大量活性蛋白酶等物質(zhì)，屬于純天然營(yíng)養(yǎng)保健食品，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、改善睡眠等極其重要的功能[1]。但蜂王漿中含有的一些活性成分穩(wěn)定性較差，對(duì)貯存條件要求較高。蜂王漿品質(zhì)變差主要體現(xiàn)在水溶性蛋白的降解[2-5]。張紅城等[6]研究表明，隨著蜂王漿在室溫貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，其含有的水溶性蛋白85.2 kDa(葡萄糖氧化酶)和MRJP-4發(fā)生較大程度降解，因此，蛋白質(zhì)的變化可作為鑒別蜂王漿品質(zhì)的指標(biāo)[6-8]。但目前對(duì)蜂王漿品質(zhì)變化的檢測(cè)主要是通過(guò)高效液相色譜法、SDS-PAGE凝膠電泳等方法進(jìn)行，專業(yè)性強(qiáng)，技術(shù)難度大，且需要昂貴的儀器設(shè)備。探究一種快速、無(wú)損的方法來(lái)有效地鑒別不同儲(chǔ)存條件下的蜂王漿具有重要意義。

近年來(lái)中紅外光譜技術(shù)以快速、無(wú)損、高效等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，且其不需要對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)多的前處理操作就可以獲得大量信息，指紋性強(qiáng)，對(duì)樣品進(jìn)行定性分析具有較好的效果[9-12]。吳黎明等[13]利用傅里葉變換紅外光譜對(duì)蜂王漿的新鮮程度進(jìn)行研究，分析比較了蜂王漿的紅外譜圖，及其相對(duì)峰強(qiáng)與貯存條件之間的相關(guān)性，研究表明，利用紅外光譜評(píng)價(jià)不同的貯存條件下蜂王漿的新鮮度是可行的，但未結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)算法對(duì)蜂王漿紅外光譜建立定性分析模型。徐榮等[14]對(duì)比了肉蓯蓉樣品及其活性成分提取物的紅外光譜圖差異，取得3種提取物的特征紅外吸收峰，計(jì)算分析得出不同波段內(nèi)藥材圖譜與提取物的紅外相關(guān)系數(shù)呈極顯著相關(guān)，研究表明中紅外光譜可作為藥材定性分析的快速有效方法。這些研究均表明中紅外光譜在定性分析方面具有較好的應(yīng)用前景，且更容易提取出有效信息，表達(dá)出豐富的樣品信息，分子選擇性更好，在蜂產(chǎn)品定性檢測(cè)方面中具有較大的發(fā)展空間[15-19]。

本研究應(yīng)用中紅外光譜技術(shù)，以冷凍條件和室溫下儲(chǔ)存7、14、21 d的蜂王漿為樣品，采用VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀掃取、分析不同儲(chǔ)存條件下的蜂王漿中紅外光譜圖，并利用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換、savitzky-golay卷積求導(dǎo)法對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并結(jié)合支持向量機(jī)算法(support vector machine，SVM)和正交偏最小二乘判別(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)建立蜂王漿的定性分析模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供的荊條漿，共34份。

VERTEX 70傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司；智能生化培養(yǎng)箱SPX-80，杭州碩聯(lián)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

取冷凍狀態(tài)下的蜂王漿樣本34份，為避免不同樣品間的差異，取同一批冷凍蜂王漿樣品分裝到離心管中，將分裝出來(lái)的34份樣品放置在25 ℃的生化培養(yǎng)箱，以模擬室溫，同時(shí)避免了室內(nèi)溫度的不確定性。蜂王漿樣品的培養(yǎng)方案：冷凍、室溫條件下分別儲(chǔ)存7、14、21 d。

為避免蜂王漿樣品的進(jìn)一步變化，操作應(yīng)快速準(zhǔn)確，試驗(yàn)溫度保持在25 ℃左右。

1.3 光譜采集方法

試驗(yàn)采集不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿樣品中紅外光譜各34個(gè)。為了消除儀器漂移的影響，采集樣品光譜數(shù)據(jù)前，首先采集空氣光譜作為背景光譜，用樣品光譜扣除相鄰背景光譜后作為待分析的光譜數(shù)據(jù)。然后用吸管吸取少量蜂王漿樣品均勻涂抹在樣品室的衰減全反射ATR附件上，為避免樣品間的交叉污染，每掃取完1個(gè)樣品需要用酒精將樣品室清洗干凈。儀器參數(shù)設(shè)置為分辨率4 cm-1,樣本掃描次數(shù)為16次，背景掃描次數(shù)16次，光譜范圍4 500～600 cm-1。并利用OPUS 7.2軟件進(jìn)行光譜采集。

1.4 譜圖分析

圖1 不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿中紅外光譜圖

Fig.1 Mid-IR spectra of royal jelly under different storage conditions

圖2 不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿中紅外光譜圖譜峰變化

Fig.2 Peak change of Mid-IR spectrum in royal jelly under different storage conditions

1.5 光譜圖預(yù)處理

在光譜采集過(guò)程中，儀器采集的噪聲及與自身信息無(wú)關(guān)的變量等一些干擾因素會(huì)影響模型的預(yù)測(cè)能力，因此為保證模型的穩(wěn)定性，建模之前需要對(duì)原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，從而獲得更多有效的樣本信息[23]，并在此基礎(chǔ)上對(duì)光譜圖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate correction，SNV)和Savitzky-Golay卷積求導(dǎo)(平滑點(diǎn)數(shù)為7)。圖3為冷凍儲(chǔ)存蜂王漿的原始中紅外光譜圖和預(yù)處理后的光譜圖。

圖3 光譜預(yù)處理前后對(duì)比圖

Fig.3 Comparison chart before and after spectral pretreatment

2 結(jié)果與分析

2.1 支持向量機(jī)算法

如圖2所示，不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿光譜圖之間差異很小，很難用肉眼區(qū)分樣本所屬類別，需要利用定性方法建立定性模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)蜂王漿的快速鑒別。本研究采用支持向量機(jī)(SVM)算法，建立蜂王漿不同儲(chǔ)存條件的快速鑒別模型。SVM是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別算法，可解決小樣本、高維度和非線性的問(wèn)題。它的基本思想是通過(guò)核函數(shù)將線性不可分的輸入數(shù)據(jù)映射到更高維的特征空間，求解線性約束問(wèn)題后找到可以線性分割輸入數(shù)據(jù)的最大間隔分類面。故采用SVM建立不同儲(chǔ)存條件蜂王漿的定性分析模型[24-25]。

首先建立不同儲(chǔ)存條件的二分類模型。采用基于網(wǎng)格搜索及交叉驗(yàn)證方法進(jìn)行參數(shù)尋優(yōu)的SVM多分類算法，以冷凍王漿與室溫王漿(儲(chǔ)存7 d)為樣本，對(duì)預(yù)處理后的樣本建立不同儲(chǔ)存溫度蜂王漿的二分類模型。其中隨機(jī)選取建模集樣本55個(gè)，預(yù)測(cè)集樣本13個(gè)。建模結(jié)果如圖4所示，其中箭頭所指為誤分類樣本?？梢钥闯鰞H有一個(gè)樣本被誤分類，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為92.31%。

圖4 基于SVM的不同儲(chǔ)存溫度二分類模型

Fig.4 Two-class model of different storage temperatures based on SVM

為進(jìn)一步探究中紅外光譜在鑒別室溫下儲(chǔ)存不同時(shí)間蜂王漿的可行性，對(duì)室溫下儲(chǔ)存7、14、21 d的蜂王漿樣本建立不同儲(chǔ)存時(shí)間的三分類模型。共102個(gè)樣本，隨機(jī)選取82個(gè)樣本作為建模集，20個(gè)樣本作為測(cè)試集。建模結(jié)果如圖5所示，隨機(jī)選取的3類測(cè)試集樣本全部分類正確，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為100%。為進(jìn)一步驗(yàn)證同時(shí)探究最優(yōu)判別方法，采用判別分析方法建立模型。

圖5 基于SVM的室溫儲(chǔ)存不同時(shí)間三分類模型

Fig.5 Three-class model of different times of store at room temperature based on SVM

2.2 正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析是基于偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法發(fā)展起來(lái)的算法，OPLS-DA法主要反映了自變量和因變量間的線性關(guān)系，并基于X變量建立Y變量的預(yù)測(cè)模型，根據(jù)X變量所得新的預(yù)測(cè)集數(shù)據(jù)構(gòu)建預(yù)測(cè)變量Y。與PLS-DA不同的是，OPLS-DA將X變量中的系統(tǒng)變異分解為同Y線性相關(guān)的部分和同Y正交的部分，且正交變異組分的增加可以減少結(jié)果誤差[26-28]。本試驗(yàn)采用交叉驗(yàn)證的方法對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，即數(shù)據(jù)模型樣本共N個(gè)，進(jìn)行N次訓(xùn)練每次訓(xùn)練樣本數(shù)為N-1個(gè)，由此獲得模型預(yù)測(cè)指數(shù)，以實(shí)現(xiàn)模型的分類鑒別等目的。

以冷凍王漿與室溫王漿(儲(chǔ)存7 d)為樣本建立不同儲(chǔ)存溫度的二分類模型。篩選出4個(gè)主成分，模型的自變量擬合指數(shù)(R2X)為0.859，說(shuō)明4個(gè)主成分解釋了85.9%的X變量；因變量擬合指數(shù)(R2Y)為0.88，說(shuō)明4個(gè)主成分解釋了88%的Y變量；模型預(yù)測(cè)指數(shù)(Q2)為0.775，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)能力為77.5%，內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差(the root mean square error of cross-validation, RMSECV)值為0.23(表2)。一般R2和Q2>5時(shí)，認(rèn)為模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力較好，故可以認(rèn)為試驗(yàn)所建模型是穩(wěn)定且可靠的。不同儲(chǔ)存溫度OPLS-DA得分圖如圖6所示，可以看到冷凍儲(chǔ)存樣本與室溫儲(chǔ)存樣本2類樣本中僅有少數(shù)重疊，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為95.52%。

圖6 不同儲(chǔ)存溫度OPLS-DA得分圖

Fig.6 OPLS-DA score plot of different storage temperatures

室溫儲(chǔ)存7、14、21 d的蜂王漿共102個(gè)為樣本，建立基于OPLS-DA室溫儲(chǔ)存不同時(shí)間蜂王漿的三分類模型，篩選出2個(gè)主成分時(shí)，R2X為0.701，R2Y為0.639，模型預(yù)測(cè)指數(shù)Q2最高為0.719，RMSECV為0.24(表2)。圖7為室溫不同儲(chǔ)存時(shí)間OPLS-DA得分圖，從圖中可以看出，3類樣本完全分離，建模效果較理想，可靠性高，模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為96.97%。

圖7 室溫儲(chǔ)存不同時(shí)間OPLS-DA得分圖

Fig.7 OPLS-DA score plot of different times of store at room temperature

表2 模型參數(shù)與預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 2 Model parameters and results

分類模型R2XR2YQ2RMSECV總體預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率/%二分類模型0.8590.880.7750.2395.52三分類模型0.7010.6390.7190.2496.97

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用中紅外光譜技術(shù)結(jié)合SVM和OPLS-DA法對(duì)不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿樣品進(jìn)行了定性分析探究。通過(guò)對(duì)光譜圖的分析發(fā)現(xiàn)，不同儲(chǔ)存條件的蜂王漿樣本在中紅外光譜的1 480～1 800 cm-1和900～1 200 cm-1存在一定的位移，對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理后結(jié)合SVM和OPLS-DA法建立了不同儲(chǔ)存條件蜂王漿的定性分析模型。其中基于SVM算法建立蜂王漿不同儲(chǔ)存溫度的定性模型預(yù)測(cè)正確率達(dá)到了92.31%，3類室溫條件儲(chǔ)存不同時(shí)間的蜂王漿定性分析模型預(yù)測(cè)正確率達(dá)到了100%。結(jié)合OPLS-DA法所建不同儲(chǔ)存溫度蜂王漿二分類模型和室溫儲(chǔ)存不同時(shí)間蜂王漿的三分類模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率分別為95.52%和96.97%。結(jié)果表明，基于SVM和OPLS-DA法建立不同儲(chǔ)存條件下的蜂王漿定性分析模型，模型效果較為理想，模型分類準(zhǔn)確率高；同時(shí)表明采用中紅外光譜技術(shù)作為一種快速、無(wú)損的方法對(duì)不同儲(chǔ)存條件下的蜂王漿進(jìn)行檢測(cè)具有一定的可行性。