楊華,宋昭,戴航,陳雄,李欣,陳守文,蔡冬波,李俊輝,王志*
1(發(fā)酵工程教育部重點實驗室,湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心,湖北省工業(yè)微生物重點實驗室,湖北工業(yè)大學,湖北 武漢,430068) 2(省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室(湖北大學),湖北 武漢,430062) 3(綠康生化股份有限公司,福建 浦城,353400)
地衣芽胞桿菌是革蘭氏陽性的產(chǎn)芽胞兼性厭氧微生物,能分泌淀粉酶、蛋白酶等水解酶[1-3],以及肽類抗生素,其中包括桿菌肽。通過非核糖體合成酶系合成的十二環(huán)肽分子[4]-桿菌肽具有廣譜抗菌、藥物殘留量少、無抗藥性等優(yōu)良特性,是目前國際社會允許使用的為數(shù)不多的綠色飼料添加劑之一[5]。
地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽的過程中,細胞優(yōu)先使用速效碳、氮源已獲得最大的生長速率[6],并伴隨著培養(yǎng)環(huán)境、營養(yǎng)成分改變做出快速響應,如呼吸代謝抑制[7]、溢流代謝[8]等碳分解代謝阻遏的具體表現(xiàn)形式[9-10]。通過提高溶氧(dissolved oxygen, DO)促進氨基酸代謝[11]、中期流加H2O2降低溢流代謝程度[12],以及提高乙偶姻還原酶活性,降低胞內(nèi)NADH/NAD+比率[13]等方法,均可以提高桿菌肽合成效率。而在桿菌肽補料發(fā)酵方面,劉道奇等發(fā)現(xiàn)葡萄糖補料能促進細胞溢流代謝,但桿菌肽的合成被抑制[14]。另外,桿菌肽發(fā)酵過程中培養(yǎng)基黏度大,易起泡,細胞數(shù)可高達百億CFU/mL等因素,均使氧的供應及利用效率逐漸降低[11],使得發(fā)酵前期DO跌至零[12]、中期菌體自溶[13]。就增加發(fā)酵液DO而言,工業(yè)上常增加通風量和提高轉(zhuǎn)速,但會增加能耗,也不利于泡沫的控制[15],而適量升高罐壓可以有效避免上述不利因素,如陳偉波等[16]將罐壓由0.02 MPa升至0.06 MPa,L-精氨酸產(chǎn)量提高了34%。另外,桿菌肽合成也與其前體氨基酸的供應效率呈正相關(guān),如ORN[21]、Asp、Glu、Asn、His、Ile、Lys等[11]。因此,桿菌肽合成涉及到了碳-氮-氧等綜合因素,而相關(guān)的綜合研究還未見報道。
以工業(yè)地衣芽孢桿菌LC為發(fā)酵菌株,本文探索了pH耦合、間歇補料-罐壓控制和間歇-溶氧耦合流加等方式對細胞生長、代謝和桿菌肽合成的影響,建立了基于細胞需求的綜合補料策略,有效提高了桿菌肽發(fā)酵效率,為桿菌肽工業(yè)化生產(chǎn)的補料工藝優(yōu)化提供了重要參考。
地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisLC,LC菌株),湖北大學綠康生物工程研究所提供。
茄子瓶斜面培養(yǎng)基(g/L):酵母浸膏20, NaCl 5,瓊脂20,調(diào)pH 7.5。
種子培養(yǎng)基(g/L):豆粕90,玉米淀粉40,玉米漿2.5,輕質(zhì)CaCO34,蛋白胨 5,(NH4)2SO41。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):豆粕79,玉米淀粉37.5,玉米漿7.5,輕質(zhì)CaCO34.5,蛋白胨 15,(NH4)2SO40.75,MgSO4·7H2O 1.1。
1.3.1 種子活化
無菌竹簽轉(zhuǎn)接-80 ℃保藏甘油管菌液至茄子瓶斜面,在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。
1.3.2 種子培養(yǎng)
茄子瓶斜面加50 mL無菌水制備菌懸液,取4 mL菌懸液接種于搖瓶中(裝液量50 mL)。37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24 h,合瓶得到種子液。
1.3.3 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)
種子液接種后發(fā)酵液體積27 L,接種量5%,在通風量1.6 m3/h、溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速350 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)。
1.3.4 50 L罐發(fā)酵策略控制
發(fā)酵1:按發(fā)酵培養(yǎng)基配方進行發(fā)酵培養(yǎng),罐壓0.03 MPa。
發(fā)酵2:pH耦合補料策略,基于發(fā)酵1實施。于18~20 h補氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g),22~28 h采用pH耦合補糖。pH值設定方式為:22~24 h為7.5,22~28 h每2 h的pH設定值上升0.1,28 h后pH自然。發(fā)酵過程中共補入質(zhì)量分數(shù)為75%的葡萄糖溶液400 mL,罐壓0.03 MPa。
發(fā)酵3:18~20 h補氮源3.0 L(含豆粕500 g、玉米漿250 g),其他同發(fā)酵2,補入葡萄糖340 g。
發(fā)酵4:間歇補料策略,從18 h開始,以200 mL/3 h的速率補入1 L質(zhì)量分數(shù)為75%的葡萄糖溶液(750 g),第30小時補完。于18~20 h補氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g),罐壓0.03 MPa。
發(fā)酵5:間歇補料-罐壓控制策略,基于發(fā)酵4,并且24 h至發(fā)酵結(jié)束罐壓維持在0.05 MPa。
發(fā)酵6:間歇-溶氧耦合補料策略。基于發(fā)酵5,18~21 h間歇補料,24 h開始將補料方式改為DO耦合(溶氧>35%時,耦合補入質(zhì)量分數(shù)為75%的葡萄糖溶液),24 h至發(fā)酵結(jié)束罐壓維持在0.05 MPa。共補入葡萄糖500 g。
發(fā)酵7:間歇-溶氧耦合-二次氮源補料策略,基于發(fā)酵6。另外,在24~25 h第2次補入氮源1.5 L(含豆粕250 g、玉米漿125 g),發(fā)酵過程中共補入葡萄糖436 g。
1.4.1 葡萄糖的測定
DNS法[12]。
1.4.2 桿菌肽效價測定
采用Ultimate 3000高效液相色譜進行桿菌肽效價測定[14],桿菌肽標準品(效價為65.8 U/mg)。
1.4.3 生物量的測定
采用稀釋平板涂布法獲得CFU/mL數(shù)據(jù)。
1.4.4 數(shù)據(jù)處理
所有試驗數(shù)據(jù)為至少3個平行試驗的平均值,用平均值±標準差(SD)表示,采用Origin 9.0進行數(shù)據(jù)分析。
發(fā)酵1中桿菌肽效價、生物量、pH值和還原糖的變化如圖1所示。
圖1 發(fā)酵1對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.1 Influences of fermentation 1 on cell growth and bacitracin synthesis
桿菌肽效價在24 h達到峰值793 U/mL,平均桿菌肽合成速率為33 U/(mL·h)。菌體快速生長至18 h,之后趨于穩(wěn)定,并在21 h達到峰值35×109CFU/mL。21~24 h,還原糖基本耗完,菌體于24 h自溶。因此,應在21 h之前開始補料,以維持細胞代謝和桿菌肽的合成。
在發(fā)酵策略1中,21 h后還原糖基本耗完(圖1),碳源不足使氨基酸脫氨基作用加強,導致pH上升過快,菌體自溶,影響桿菌肽合成[17]。因此采用階梯控制pH的方式來耦合流加葡萄糖,延緩pH上升速度的同時補充碳源。另外,有機氮源對于細菌的生長和代謝也是必不可少的,并且富含桿菌肽合成的前體氨基酸。WANG等[18]研究了豆粕、菜籽餅、芝麻餅粉、花生餅粉等氮源對桿菌肽合成的影響,發(fā)現(xiàn)豆粕中氨基酸種類豐富,是桿菌肽發(fā)酵過程中的最佳單一氮源。但是豆粕在發(fā)酵過程中分解較為緩慢,所以考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基中已有的速效氮源-玉米漿混合使用。在18~20 h補入玉米漿和豆粕,形成發(fā)酵策略2。發(fā)酵過程中桿菌肽效價、生物量、pH、還原糖變化如圖2所示。
圖2 發(fā)酵2對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.2 Influences of fermentation 2 on cell growth and bacitracin synthesis
桿菌肽效價持續(xù)合成至30 h達到峰值(1 006 U/mL),平均合成速率為33.5 U/(mL·h)。菌體生物量在27 h達到峰值(42×109CFU/mL)后發(fā)生了自溶。糖質(zhì)量濃度在18~24 h快速下降(8.7~3.1 g/L),但由于18~22 h的pH值<設定值,期間未補入葡萄糖。pH耦合補糖期間(22~28 h)的葡萄糖質(zhì)量濃度維持在3 g/L左右,效價最高點(30 h)還原糖質(zhì)量濃度為2.6 g/L。與發(fā)酵1相比,保持桿菌肽平均合成速率不變,合成時間延長了6 h,效價提高了26.9%。
作為十二環(huán)肽分子,發(fā)酵過程中氮源的充分供給是桿菌肽有效合成的基礎,由于發(fā)酵2在18 h補充氮源后效價得到明顯提升,于是在發(fā)酵2的基礎上,繼續(xù)加大氮源的補入量,形成了補料策略3。發(fā)酵過程中桿菌肽效價、生物量、pH、還原糖的變化如圖3所示。
圖3 發(fā)酵3對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.3 Influences of fermentation 3 on cell growth and bacitracin synthesis
桿菌肽效價持續(xù)合成至32 h達到峰值958 U/mL,比發(fā)酵2減少了4.8%。菌體生物量24 h達到峰值40×109CFU/mL,與發(fā)酵2峰值生物量相當。葡萄糖質(zhì)量濃度在18~24 h快速下降(8.5~3.6 g/L),之后一直維持低位。通過增加氮源補入量,并沒有進一步提高桿菌肽效價,可能是因為加大氮源的補入,增加了菌體分解和轉(zhuǎn)運大分子蛋白質(zhì)的負擔,加速了能量的消耗[19,22]。另外,氮源補入量增加而碳源的補加量并未相應調(diào)整,導致碳氮源比例失衡,也影響了氮源的利用效率[20],此時桿菌肽轉(zhuǎn)運蛋白bcrABC也可能被抑制[23-24]。最終桿菌肽效價只有發(fā)酵2的95%。
發(fā)酵3效價低于發(fā)酵2,說明一味提高氮源濃度會導致碳氮比失衡,從而影響桿菌肽的合成[25-26]。而采用pH耦合流加葡萄糖的方式,無法在pH較低時補加葡萄糖。于是以發(fā)酵2為基礎,基于18~24 h葡萄糖質(zhì)量濃度降低5.6 g/L,以及發(fā)酵3在18 h后葡萄糖供給不足的現(xiàn)象,采用間歇補料的方式,在18~30 h每3 h補入5.6 g/L的葡萄糖(200 mL的75%葡萄糖溶液/3 h),形成發(fā)酵策略4(間歇式補料),見圖4。
圖4 發(fā)酵4對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.4 Influences of fermentation 4 on cell growth and bacitracin synthesis
如圖4所示,菌體生物量持續(xù)合成至27 h并達到峰值56.8×109CFU/mL,比發(fā)酵2提高了35.2%,和發(fā)酵2相比,以200 mL/3 h補入葡萄糖的方式更能促進菌體的生長,但生物量過高后,菌體維持代謝所需要的葡萄糖、氮源以及溶氧等無法得到保障,營養(yǎng)和能量供應受限,開始大量自溶[12]。桿菌肽效價在30 h達到峰值(1 070 U/mL),比發(fā)酵2和發(fā)酵3分別提高了6.4%和11.7%,桿菌肽平均合成速率為35.7 U/(mL·h),略高于發(fā)酵2。與發(fā)酵2相比,雖然發(fā)酵過程中多補入了450 g葡萄糖(其中18~21 h補入300 g),但葡萄糖并沒有在胞外積累。18~24 h葡萄糖質(zhì)量濃度從8.8 g/L降到3 g/L,之后維持低位。
根據(jù)圖1~4試驗結(jié)果,實驗條件下桿菌肽發(fā)酵峰值細胞數(shù)可達百億級CFU/mL,對溶氧的需求極大。而由圖5可知,18 h補料后溶氧降為0,因此推測DO不足使得氧化磷酸化供能效率低,可能是桿菌肽效價無法繼續(xù)有效合成的原因。于是基于發(fā)酵4,在24 h將罐壓從0.03 MPa提高到0.05 MPa,研究其對24 h前后生長和桿菌肽合成的影響(圖5)。
圖5 發(fā)酵5對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.5 Influences of fermentation 5 on cell growth and bacitracin synthesis
如圖5所示,24 h罐壓提高到0.05 MPa,桿菌肽效價持續(xù)合成至30 h達到峰值(1 118 U/mL),比發(fā)酵4提高了4.5%,說明提高溶氧對桿菌肽合成有積極的影響。但提高溶氧對生物量的影響不明顯,菌體生物量在27 h達到峰值(55.6×109CFU/mL)后的變化趨勢和峰值濃度都和發(fā)酵4基本一致,說明細胞數(shù)在峰值條件下,能量供應及碳源不足可能與菌體自溶有關(guān)。
18~24 h葡萄質(zhì)量糖濃度從8.2 g/L降到2.3 g/L,變化趨勢與發(fā)酵4一致。另外,18 h補入氮源和葡萄糖后,DO即從14%降為0并一直維持至26 h左右,并沒有因24 h升罐壓而立即升高。期間大量碳源和氮源被消耗,菌體代謝活躍。隨著細胞生長和碳氮源的消耗,碳源不足可能引起了細胞氧化磷酸化的耗氧降低,使DO于26 h開始回升,并于27 h達到55%。此時桿菌肽效價(1 040 U/mL)比發(fā)酵4(975 U/mL)提高了7%。隨著27 h間歇補料(200 mL的質(zhì)量分數(shù)為75%葡萄糖),DO再次被大量消耗而跌為0,說明26 h時碳源供應確實處于不足狀態(tài),使氧化磷酸化對溶氧的消耗減少。
30 h間歇補料后,由于此時細胞數(shù)只有27 h的61%,對碳源的需求減少。仍按200 mL/3 h的葡萄糖補入量對于此時(30 h)的細胞而言,可能已經(jīng)過量,CcpA被激活[10],氧化磷酸化作用被抑制[9],菌體對氧的利用速率反而減小,因而DO沒有像27 h那樣出現(xiàn)跌0的情況;
另外,溢流代謝被激活,大量的小分子有機酸如乙酸被合成[8],引起pH在發(fā)酵后期由8.7下降至8.4,補入的葡萄糖通過溢流代謝僅僅維持了細胞活性,但并沒有促進桿菌肽效價的合成。
發(fā)酵4和5中菌體生物量在27 h分別達到了56.8×109CFU/mL和55.6×109CFU/mL,比發(fā)酵1(未補料)提高了60%左右,但高菌體量也激化了能量供應的矛盾。至30 h時,細胞又自溶了40%左右,這也造成了碳氮源的浪費。而且,這種間歇補料的方式在25~26 h溶氧開始回升時并不能及時補入葡萄糖;而在30 h菌體自溶后對碳源需求量減小時,又補入了過量的碳源,所以在24 h后應采用溶氧耦合的方式根據(jù)細胞對碳源的需求補入葡萄糖,形成發(fā)酵策略6(圖6)。
圖6 發(fā)酵6對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.6 Influences of fermentation 6 on cell growth and bacitracin synthesis
如圖6所示,菌體生物量在24 h即達到峰值46×109CFU/mL,和發(fā)酵5在24 h的菌體生物量相當(47.6×109CFU/mL),但比其峰值生物量減少了17%。雖然菌體在24 h后就逐漸自溶,但桿菌肽的合成速率沒有受到影響,進一步說明桿菌肽的合成不需要維持菌體的高生物量。
24 h開始葡萄糖耦合DO(35%)補料策略,由于24~27 h的DO一直低于35%,因而期間未補入葡萄糖。葡萄糖質(zhì)量濃度從18~24 h快速下降(7.7~3 g/L),然后一直維持在2.3 g/L左右。
桿菌肽效價近線性上升至30 h的峰值濃度1 123 U/mL,與發(fā)酵5基本一樣,但是補糖量總計500 g,比發(fā)酵5補糖量(750 g)減少了33.3%,節(jié)約了成本。而且這種基于DO耦合的補料方式滿足了細胞對DO-糖代謝匹配的需求,桿菌肽對糖的得率系數(shù)(YP/S)提高了22.7%(表1)。
鑒于發(fā)酵6和發(fā)酵5的試驗結(jié)果,考慮到桿菌肽合成不僅與糖和DO有關(guān),更是涉及到碳-氮-氧的綜合因素,因此,在發(fā)酵6的基礎上,于24 h二次補入氮源(豆粕250 g、玉米漿125 g)形成發(fā)酵策略7,考察其對桿菌肽合成的影響。
如圖7所示,桿菌肽效價持續(xù)合成至30 h,達到峰值1 220 U/mL,比發(fā)酵6提高了9.1%,說明24 h后,氮源不足是影響桿菌肽合成的另一個重要因素。另外,雖然生物量于24 h達到峰值(45×109CFU/mL)后自溶,但是27 h時細胞僅自溶了11%,相比于發(fā)酵6(自溶率33%)降低了66%。說明綜合匹配碳-氮-氧3個關(guān)鍵因素的補料方式能有效地維持細胞在發(fā)酵中后期的代謝活性,形成了基于細胞生理需求的發(fā)酵策略,突破了有關(guān)葡萄糖不適宜作為桿菌肽補料碳源的認知,并提高了桿菌肽的合成效率[40.67 U/(mL·h)],比相關(guān)報道[14]的桿菌肽合成效率[29 U/(mL·h)]提高了40.3%。
圖7 發(fā)酵7對細胞生長和桿菌肽合成的影響
Fig.7 Influences of fermentation 7 on cell growth and bacitracin synthesis
為了進一步分析補料策略對桿菌肽合成的影響,對發(fā)酵1~7進行了總結(jié),相關(guān)參數(shù)如表1所示。
表1 所有試驗批次相關(guān)參數(shù)情況
注:效價為發(fā)酵過程中桿菌肽的最高效價;生物量為發(fā)酵過程中菌體的最高生物量;YP/S是糖對新增桿菌肽的得率系數(shù),糖質(zhì)量=效價達到峰值時補入的糖質(zhì)量,新增效價=峰值效價-793,體積按27 L計,桿菌肽效價的質(zhì)量系數(shù)為65.8 U/mg;平均桿菌肽合成速率為從發(fā)酵開始到桿菌肽達到最大值的平均桿菌肽合成速率。
如表1所示,發(fā)酵7桿菌肽效價最高,分別比發(fā)酵2、4提高了21%和14%。通過提高罐壓(增強氧的供應強度)、補入碳源、氮源,桿菌肽效價比未補料(發(fā)酵1)提高了54%,平均桿菌肽合成速率提高了23.1%,節(jié)省了發(fā)酵時間。同時發(fā)酵7形成了基于細胞碳氮源和能量需求的補料模式,其YP/S(葡萄糖桿菌肽得率)達到了0.4 g/g,遠高于其他補料試驗批次。
本研究探索了碳、氮源的間歇補加、pH耦合流加、氧的供應強度以及DO耦合流加對細胞生長、代謝和桿菌肽合成的影響。結(jié)論如下:
(1)pH耦合補料策略(18 h補入氮源、pH耦合補糖)的桿菌肽效價(1 006 U/mL)比對照提高了27%,但當18~22 h需要增加葡萄糖供應量時,卻存在因pH低于耦合設定值而無法補入的缺陷。
(2)間歇補料-罐壓控制策略(18 h補入氮源、間歇補糖、罐壓控制)的效價(1 118 U/mL)比對照提高了41%,也比pH耦合策略提高了11%,但存在發(fā)酵后期碳源不足時(溶氧迅速回升至55%),葡萄糖無法及時補入、而細胞自溶后對糖需求量減少時仍按設定值補入的缺陷,即存在發(fā)酵后期補糖量與DO不匹配的問題。
(3)采用間歇-DO耦合補料策略(18 h補入氮源、18~21 h間歇補糖,24 h以后耦合DO補料、罐壓控制),可以避免18~24 h葡萄糖補入量不足和發(fā)酵后期葡萄糖補入過量的問題,雖然桿菌肽效價為1 123 U/mL,但是由于補糖量比間歇補料-罐壓控制模式減少了33.3%,因此桿菌肽對糖的得率系數(shù)(YP/S)提高了22.7%。
(4)基于間歇-DO耦合補料策略于24 h二次補入氮源后,桿菌肽效價峰值達到了1 220 U/mL,比pH耦合、間歇補料-罐壓控制分別提高了21%和9.1%,平均桿菌肽合成速率為40.67 U/(mL·h),突破了有關(guān)葡萄糖不適宜作為桿菌肽補料碳源的認知,形成了基于細胞需求的綜合碳-氮-氧因素的補料策略,為工業(yè)化補料發(fā)酵生產(chǎn)桿菌肽提供了重要參考。