程樹(shù)林 蔡濤 周文浩 陳雙全 朱平宇

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（四川南充 637000）

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤之一，對(duì)男性健康和生命產(chǎn)生嚴(yán)重威脅[1]。前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制具有重要臨床意義。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，最初被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能，是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的“噪音”[2]。伴隨lncRNA研究領(lǐng)域的拓展，lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活、基因組印跡、X染色體沉默等眾多生物調(diào)控[3]。近年的研究表明，大量lncRNA在腫瘤中表達(dá)異常，與腫瘤的診斷、治療效應(yīng)、預(yù)后等密切相關(guān)[4]。AL451105.2是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在疾病尤其是前列腺癌中的功能仍不清楚。本研究旨在檢測(cè)AL451105.2在前列腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)染AL451105.2質(zhì)粒至前列腺癌細(xì)胞，觀察AL451105.2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響，進(jìn)一步探討AL451105.2可能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料16例前列腺癌組織標(biāo)本來(lái)源于2017年3月至2018年7月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除標(biāo)本，均經(jīng)病理學(xué)確診為前列腺癌。前列腺癌患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療?；颊呔炇鸨驹簜惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)的知情同意書(shū)。KSFM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。前列腺癌細(xì)胞株（22RV1、C4-2B、PC-3、DU-145、LNCap）和正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）購(gòu)自武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，RWPE-1使用含10%FBS的KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)，22RV1、C4-2B、PC-3、DU-145、LNCap細(xì)胞使用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。含有AL451105.2全長(zhǎng)的質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自上海捷瑞生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司一抗β-微管蛋白（β-Tubulin）、鋅指268（ZNF268）、細(xì)胞周期蛋白E2（CyclinA2）、細(xì)胞周期蛋白 A2（CyclinA2）、神經(jīng)型鈣黏蛋白（N-cadherin）和β-連環(huán)蛋白（βcatenin）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將適量DU-145細(xì)胞接種于新的6孔板，將DU-145細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒）和實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染含有AL451105.2全長(zhǎng)的質(zhì)粒）。培養(yǎng)至60%融合時(shí)，根據(jù)LipofectamineTM2000 Reagent說(shuō)明書(shū)將脂質(zhì)體和相應(yīng)質(zhì)粒進(jìn)行稀釋?zhuān)♂屢夯靹蜢o置20 min后滴加至6孔板。轉(zhuǎn)染12 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)采用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)AL451105.2的下游miRNA，采用MicroT-CDS在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)相應(yīng)miRNA的下游靶基因。

1.2.3 qPCR檢測(cè) AL451105.2、miR-181a-5p和ZNF268 mRNA的表達(dá) 采用Trizol法提取前列腺癌組織或細(xì)胞總RNA，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qPCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，以GAPDH或U6為內(nèi)參，分別檢測(cè)AL451105.2、miR-181a-5p和ZNF268 mRNA的表達(dá)。采用特異性引物序列如下：miR-181a-5p：上游：GGAACATTCAACGCTGTCG，下游：CAGTGCGTGTCGTGGAGT；GAPDH：上游：CTGGGCTACACTGAGCACC，下游：AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG；AL451105.2：上游：AAGGGTTGGGGTTTGTTAGAA，下游：TAGCATGGCTGCCTGACTTA；ZNF 268：上游：CAGCTTCTATTTGGGTCCCAC，下游：ATTCTGCGACTCTTCTGCTTC。

1.2.4 Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá) DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化兩組細(xì)胞。采用細(xì)胞裂解液裂解并提取細(xì)胞總蛋白，每組取40 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜。采用5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，采用相應(yīng)一抗4℃孵育過(guò)夜。洗膜后相應(yīng)二抗室溫下孵育1 h，洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

1.2.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化兩組細(xì)胞，分別以每孔2×103個(gè)接種于96孔板，在每個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，吸出培養(yǎng)基后加入20 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，取出后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm處96孔板每孔的吸光度。分別檢測(cè)1、2、3、4、5 d細(xì)胞吸光度。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 Transwell實(shí)驗(yàn)DU-145細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化兩組細(xì)胞，使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞密度為2× 105個(gè)/mL，每組取200 μL細(xì)胞懸液加入預(yù)先用Matrigel基質(zhì)膠鋪墊的Transwell小室中，在下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出小室并采用PBS溶液洗3次，甲醇固定10 min，結(jié)晶紫溶液染色10 min。每組分別取4個(gè)視野，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每組穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值比較各組細(xì)胞侵襲能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)設(shè)置至少3個(gè)平行組，以上所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用t檢驗(yàn)比較差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和癌旁組織中AL451105.2的表達(dá)AL451105.2在前列腺癌組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)分別為（0.60±0.06）和（2.39±0.14），AL451105.2在前列腺癌組織中的相對(duì)表達(dá)明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 qPCR檢測(cè)AL451105.2在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 qPCR detection of AL451105.2 expression in prostate cancer tissues and adjacent tissues，compared with adjacent tissues

2.2 前列腺癌細(xì)胞株中AL451105.2的表達(dá)AL451105.2在前列腺癌細(xì)胞株（22RV1、C4-2B、PC-3、DU-145、LNCap）和正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE-1）中的相對(duì)表達(dá)分別為（0.72±0.03）、（0.47 ± 0.02）、（0.33 ± 0.05）、（0.17 ± 0.01）、（0.62±0.02）和（1.00±0.07），AL451105.2在前列腺癌細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)低于正常前列腺上皮細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在DU-145細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)最低（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

2.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AL451105.2的下游基因采用LncBase Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)AL451105.2的下游miRNA是miR-181a-5p，采用MicroT-CDS在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-181a-5p的下游靶基因是ZNF268，見(jiàn)圖3。

圖2 qPCR檢測(cè)AL451105.2在前列腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.2 qPCR detection of AL451105.2 expression in prostatecancer cell lines

圖3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)AL451105.2的下游基因Fig.3 Bioinformatics predicts downstream genes for AL451105.2

2.4 兩組DU-145細(xì)胞中AL451105.2、miR-181a-5p和ZNF268mRNA的表達(dá) 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞中AL451105.2的相對(duì)表達(dá)分別為（1.07±0.24）和（7.60±0.37），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組中AL451105.2的相對(duì)表達(dá)明顯增加。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞中miR-181a-5p的相對(duì)表達(dá)分別為（1.03±0.14）和（0.28±0.06），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組中miR-181a-5p的相對(duì)表達(dá)明顯減少。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞中ZNF268 mRNA的相對(duì)表達(dá)分別為（1.00±0.05）和（5.51±0.43），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)組中ZNF268 mRNA的相對(duì)表達(dá)明顯增加。

2.5 ZNF268和細(xì)胞增殖侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)變化前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染AL451105.2后，ZNF268蛋白表達(dá)升高，與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白CyclinE2和CyclinA2表達(dá)降低，間質(zhì)表型N-cadherin表達(dá)降低，上皮表型β-catenin表達(dá)升高。見(jiàn)圖4。

2.6 AL451105.2對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞增殖的影響CCK-8法檢測(cè)兩組DU-145細(xì)胞的增殖能力，酶標(biāo)儀檢測(cè)并繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞由第3天開(kāi)始，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，提示AL451105.2可以抑制DU-145細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.7 AL451105.2對(duì)前列腺癌DU-145細(xì)胞侵襲能力的影響Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組DU-145細(xì)胞的侵襲能力，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞在24 h的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為（165.40±17.02）和（41.07±6.36），實(shí)驗(yàn)組DU-145細(xì)胞侵襲能力明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），提示AL451105.2可抑制DU-145細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖6。

圖4 Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中ZNF268蛋白及下游蛋白的表達(dá)Fig.4 Western blot was used to detect the expression of ZNF268 protein and downstream protein in the two groups

圖5 CCK-8法檢測(cè)兩組DU-145細(xì)胞的增殖能力Fig.5 CCK-8 was used to detect the proliferation of DU-145 cells

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩組DU-145細(xì)胞的侵襲能力Fig.6 Transwell assay was used to detect the invasive ability of two groups of DU-145 cells

3 討論

lncRNA是一類(lèi)RNA聚合酶Ⅱ的副產(chǎn)物，包含多個(gè)終止密碼子或無(wú)有效的開(kāi)放閱讀框，并不能編碼蛋白質(zhì)[5]。lncRNA以RNA的形式參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[6]。大量的研究表明，lncRNA與腫瘤特別是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系[7]。在前列腺癌中，多條lncRNAs被發(fā)現(xiàn)與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，包括XIST[8]、PVT1[9]、GAS5[10]、FALEC[5]等，為前列腺癌的發(fā)生機(jī)制、診斷、治療效應(yīng)、預(yù)后提供了重要的分子標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。AL451105.2作為一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長(zhǎng)度為1 234核苷酸，其在前列腺癌中的表達(dá)和作用機(jī)制仍不清楚。

本研究通過(guò)qPCR檢測(cè)前列腺癌組織和細(xì)胞中AL451105.2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AL451105.2在前列腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，表明AL451105.2可能成為一種新型的前列腺癌診斷標(biāo)志物。在前列腺癌細(xì)胞系DU-145中采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，轉(zhuǎn)入含有AL451105.2全長(zhǎng)的質(zhì)粒，通過(guò)檢測(cè)AL451105.2在轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平，表明轉(zhuǎn)染可明顯提高AL451105.2的表達(dá)水平。lncRNA的作用機(jī)制眾多，可以“海綿樣”方式吸附并調(diào)控miRNA的活性，從而影響miRNA下游靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展[7，11-12]。采用lnc-Base Predicted v.2在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)AL451105.2的下游miRNA是miR-181a-5p。有研究表明，miR-181a-5p在胃癌中的表達(dá)明顯升高，miR-181a-5p可促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，發(fā)揮癌基因的作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，AL451105.2表達(dá)增加可明顯降低miR-181a-5p的表達(dá)，AL451105.2可能具有吸附并降低miR-181a-5p表達(dá)的作用。采用MicroT-CDS在線預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-181a-5p的下游靶基因是ZNF268。ZNF268可發(fā)揮抑癌基因作用，ZNF268的低表達(dá)與白血病的發(fā)生密切相關(guān)[14]。ZNF268在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制研究很少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p表達(dá)降低可明顯升高ZNF268的表達(dá)，miR-181a-5p可能對(duì)ZNF268的表達(dá)發(fā)揮干擾作用。DU-145細(xì)胞中AL451105.2表達(dá)升高后，與細(xì)胞增殖相關(guān)的蛋白如Cyclin E2和Cyclin A2表達(dá)明顯降低，提示DU-145細(xì)胞的增殖能力降低。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是前列腺癌侵襲最重要的調(diào)控機(jī)制之一，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，主要表現(xiàn)為上皮表型如β-catenin的丟失和間質(zhì)表型如N-cadherin的獲得[15-16]。AL451105.2表達(dá)升高后，間質(zhì)表型N-cadherin表達(dá)明顯降低，上皮表型β-catenin表達(dá)明顯增加，提示AL451105.2可以抑制DU-145細(xì)胞EMT的發(fā)生，DU-145細(xì)胞的侵襲能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，AL451105.2表達(dá)升高后，DU-145細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力明顯下降，表明AL451105.2可抑制DU-145細(xì)胞的體外增殖能力和侵襲能力。

總之，AL451105.2在前列腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，AL451105.2可通過(guò)抑制miR-181a-5p的表達(dá)、促進(jìn)ZNF268基因的表達(dá)以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。AL451105.2可能是治療前列腺癌潛在的分子作用靶點(diǎn)，本研究為前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。