吳松林，田小利，徐陶，雷賢英，伍長(zhǎng)學(xué)，甘辭海

膿毒癥是指因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙［1］。當(dāng)前臨床普遍認(rèn)為，膿毒癥是一種由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征［2］；感染可能引起免疫抑制及機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生［3-4］。急性肺損傷是一種以彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷為基礎(chǔ)，肺水腫和肺不張為病理特征，并迅速影響氣體交換功能的臨床綜合征［5-6］。而急性肺損傷作為機(jī)體過(guò)度炎癥反應(yīng)的結(jié)果，調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展可以防止急性肺損傷的發(fā)生［7］，對(duì)降低病死率具有重要的臨床意義［8］。因此，急性肺損傷生物學(xué)標(biāo)志物的探索，對(duì)膿毒癥早期的診斷、療效判斷以及預(yù)后評(píng)估都有重要意義［9］。微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一類(lèi)內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)［10-11］。研究表明，多種miRNAs 在膿毒癥的炎癥反應(yīng)中起著重要的作用［12-13］，miR-125b 已被發(fā)現(xiàn)在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等癌癥中表達(dá)異常，但是關(guān)于miR-125b在膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷中的研究尚少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道［14-16］。本研究通過(guò)體外構(gòu)建膿毒癥急性肺損傷大鼠模型，探索miR-125b的表達(dá)水平與炎癥因子的相互關(guān)系，以及其在急性肺損傷中對(duì)炎癥的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液（NO.C10782730BT，美國(guó)Gbico 公司），胎牛血清（NO.10099，美國(guó)Gbico 公司），0.25%胰酶（Lot：20170321，美國(guó)Invitrogen 公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，德國(guó)），倒置顯微系統(tǒng)（TH4-200，日本OLYMPUS），TaqMan?RNA Reverse Transcription kit 試劑盒（Lot：20170634，美國(guó)ABI 公司），Lipofectamine 3000 Reagent（No.M0124，美國(guó)賽默飛生物公司），PCR 儀（iCycler Thermal Cycler，美國(guó)BIO-RAD 公司），凝膠圖像分析系統(tǒng)（Biosens SC710，美國(guó)BIOTOP 公司），熒光定量PCR 儀（Light Cycler480，美國(guó)羅氏生物），低速離心機(jī)（TDL5，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)），脂多糖（LPS，美國(guó)Sigma 公司），固型標(biāo)準(zhǔn)普通飼料（北京科澳飼料公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD大鼠100 只，雄性，5周齡，體質(zhì)量195～230 g，購(gòu)自上海南方模式動(dòng)物中心，于我院動(dòng)物科學(xué)研究室進(jìn)行喂養(yǎng)，4 只/每籠，以固型標(biāo)準(zhǔn)普通飼料飼養(yǎng)于24 ℃室溫，12 h 光照，濕度44%～50%環(huán)境下。將100只SD 大鼠隨機(jī)均分為5組：對(duì)照組注射等量的生理鹽水；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）4 h、8 h、12 h 及24 h 組，腹腔注射10 mg/kg的LPS相應(yīng)時(shí)長(zhǎng)后處死大鼠。

1.3 肺組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 各組大鼠處死后取肺組織，10%福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋。4 μm組織切片后經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光鏡（×100）下觀(guān)察肺組織切片病理學(xué)變化。

1.4 肺組織miR-125b、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測(cè) 提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，反應(yīng)條件：16 ℃30 min，42 ℃30 min，85 ℃5 min，4 ℃保存。采用TaqMan?Universal PCR Master Mix 進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，55～60 ℃退火及延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為miR-125b內(nèi)參，以β-actin為T(mén)NF-α 和IL-6 的內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物信息見(jiàn)表1。

1.5 NR8383 細(xì)胞的培養(yǎng)與分組 （1）細(xì)胞培養(yǎng)。大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383 細(xì)胞株由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供，由液氮罐中迅速取出凍存的細(xì)胞，37 ℃水浴解凍并接種，添加DMEM 培養(yǎng)液5 mL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換液1 次。貼壁細(xì)胞進(jìn)行傳代前達(dá)到80%左右融合度，采用0.25%的胰酶消化后收集細(xì)胞懸液；4 ℃3 000 r/min 離心2 min，棄去上清，加入1×PBS重懸細(xì)胞1 mL，按1×105/mL密度接種。（2）LPS 誘導(dǎo)NR8383 細(xì)胞系。將NR8383 細(xì)胞系根據(jù)不同的處理方式分為2組，空白對(duì)照組不進(jìn)行LPS刺激，實(shí)驗(yàn)組加入LPS 刺激4 、8 、12、24 h 時(shí)收集細(xì)胞。（3）細(xì)胞轉(zhuǎn)染。取培養(yǎng)3～5 代細(xì)胞，嚴(yán)格按照Lipofectamine?3000 Transfection Reagent 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作；陰性對(duì)照組只轉(zhuǎn)染空表達(dá)質(zhì)粒；miR-125b mimic 組轉(zhuǎn)染miR-125b mimic 表達(dá)質(zhì)粒，以提高細(xì)胞內(nèi)源miR-125b 的表達(dá)水平；miR-125b inhibitor 組轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor 表達(dá)質(zhì)粒，以抑制細(xì)胞內(nèi)源miR-125b的表達(dá)水平。

Tab.1 Primer sequence information表1 各引物序列信息

1.6 Western blot檢測(cè)Notch1蛋白表達(dá) 分別取各轉(zhuǎn)染組等量細(xì)胞，經(jīng)12.5%SDS-PAGE 凝膠電泳（90 V 恒壓）分離，恒流轉(zhuǎn)移后，3%BSA室溫封閉1 h，按1∶500濃度加入Notch1單克隆抗體（1∶500稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，漂洗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶1 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵?0 min 后PBS 緩沖液洗滌，加入ECL 化學(xué)發(fā)光劑曝光成像。對(duì)成像之后的膠片，采用密度掃描儀對(duì)各個(gè)條帶的吸光度值進(jìn)行定量，以β-actin作為內(nèi)參照，使用其灰度值差值來(lái)表示Notch1 的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用2獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素的方差分析，組間多重比較用采用LSD-t檢驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)組相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化 LPS 腹腔注射4 h后對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，肺泡壁完整清晰、間質(zhì)無(wú)滲出、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔內(nèi)無(wú)水腫液、出血，見(jiàn)圖1A；LPS 腹腔注射8、12、24 h 后各組大鼠肺泡隔毛細(xì)血管及肺微血管擴(kuò)張充血，雙肺體積增大，明顯肺水腫，肺泡壁破損，肺泡隔及肺泡腔內(nèi)大量液體及紅細(xì)胞滲出，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶有透明膜形成，肺泡大小不一，肺泡間隔明顯增厚，見(jiàn)圖1B～E。

2.2 各組肺組織中miR-125b、TNF-α 以及IL-6 的表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，LPS 各組TNF-α、IL-6的相對(duì)表達(dá)量均升高，miR-125b相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0.05）；與LPS 4 h 組相比，LPS 8 h 組、LPS 12 h 組及LPS 24 h 組TNF-α、IL-6 的相對(duì)表達(dá)量均降低，miR-125b相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in lung tissues of rats between five groups表2 各組大鼠肺組織中miR-125b、TNF-α以及IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較（n=20，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in lung tissues of rats between five groups表2 各組大鼠肺組織中miR-125b、TNF-α以及IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較（n=20，±s）

＊P＜0.05；a 與對(duì)照組比較，b 與LPS 4 h 組比較，c 與LPS 8 h 組比較，d與LPS 12 h組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組LPS 4 h組LPS 8 h組LPS 12 h組LPS 24 h組F TNF-α 0.68±0.31 2.67±0.72a 1.68±0.47ab 1.53±0.31ab 1.59±0.42ab 45.093＊IL-6 0.53±0.22 1.82±0.68a 1.34±0.31ab 1.09±0.32abc 1.31±0.29abd 27.597＊miR-125b 1.48±0.53 0.61±0.12a 0.58±0.10a 0.63±0.15a 0.59±0.11a 45.421＊

2.3 肺組織中miR-125b表達(dá)與TNF-α、IL-6 的表達(dá)相關(guān)性分析 實(shí)驗(yàn)組肺組織中miR-125b與TNF-α、IL-6 呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.599、-0.580，P＜0.05）。

2.4 NR8383 細(xì)胞系中miR-125b、TNF-α 以及IL-6的表達(dá)檢測(cè) 在LPS誘導(dǎo)的第4、8、12、24 h，實(shí)驗(yàn)組NR8383 細(xì)胞系miR-125b表達(dá)水平均低于對(duì)照組，而TNF-α、IL-6 的表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.5 Notch1在NR8383細(xì)胞系中的表達(dá)檢測(cè) 與陰性對(duì)照組比較，miR-125bmimic組miR-125b相對(duì)表達(dá)量升高、Notch1 蛋白相對(duì)表達(dá)量則降低（P＜0.05），miR-125binhibitor組miR-125b相對(duì)表達(dá)量降低、Notch1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與miR-125bmimic 組比較，miR-125binhibitor 組miR-125b相對(duì)表達(dá)量降低、Notch1 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），見(jiàn)表4、圖3。

Tab.3 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in NR8383 cells between different time points表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組NR8383細(xì)胞中miR-125b、TNF-α以及IL-6的表達(dá)比較（n=20，±s）

Tab.3 Comparison of expression levels of miR-125b,TNF-α and IL-6 in NR8383 cells between different time points表3 不同時(shí)間點(diǎn)各組NR8383細(xì)胞中miR-125b、TNF-α以及IL-6的表達(dá)比較（n=20，±s）

＊P＜0.05

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t miR-125b TNF-αIL-6 4 h 1.39±0.35 0.76±0.13 7.546＊8 h 1.45±0.41 0.71±0.15 7.580＊12 h 1.40±0.32 0.69±0.11 9.384＊24 h 1.38±0.31 0.63±0.13 9.978＊4 h 0.61±0.18 2.16±0.58 11.414＊8 h 0.65±0.17 2.01±0.43 13.154＊12 h 0.67±0.19 1.93±0.36 13.843＊24 h 0.60±0.14 1.90±0.32 16.645＊4 h 0.47±0.09 1.91±0.54 19.373＊8 h 0.51±0.10 1.80±0.43 13.678＊12 h 0.49±0.11 1.69±0.41 12.642＊24 h 0.48±0.10 1.67±0.38 13.544＊

Tab.4 Comparison of expression levels of miR-125b and Notch1 between three groups of cells表4 各組細(xì)胞中miR-125b與Notch1的表達(dá)比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of expression levels of miR-125b and Notch1 between three groups of cells表4 各組細(xì)胞中miR-125b與Notch1的表達(dá)比較（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與陰性對(duì)照組比較，b與miR-125b mimic組比較，P＜0.05

組別陰性對(duì)照組miR-125b mimic組miR-125b inhibitor組F miR-125b相對(duì)表達(dá)量1.42±0.23 2.14±0.56a 0.76±0.12ab 22.514＊Notch1相對(duì)表達(dá)量1.12±0.18 0.43±0.07a 1.83±0.42ab 41.286＊

Fig.3 Western blot analysis of Notch1 protein expression in three groups of cells圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Notch1蛋白表達(dá)

3 討論

感染與創(chuàng)傷是急性肺損傷發(fā)病的最常見(jiàn)原因，可直接或間接引起不同程度的肺損傷［17］。促炎反應(yīng)被啟動(dòng)的同時(shí)，抗炎反應(yīng)也被啟動(dòng)，兩者之間的平衡與傾斜決定著整個(gè)炎癥過(guò)程的歸宿，因此如何控制急性肺損傷過(guò)程中免疫炎癥反應(yīng)，對(duì)于急性肺損傷的治療至關(guān)重要［18］。

miRNAs作為一種新的基因表達(dá)調(diào)節(jié)物，它與目的mRNA結(jié)合后，可抑制目的mRNA翻譯或降解，參與多種生物過(guò)程的信號(hào)通路調(diào)控［19］。孟建斌等［20］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥引發(fā)急性肺損傷患者外周血中miR-146a 的表達(dá)顯著升高。Shi 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織在進(jìn)行LPS 刺激后，有46 種miRNAs 的表達(dá)明顯上調(diào)，多種炎癥相關(guān)因子表達(dá)下調(diào)，表明miRNAs參與肺部的急性炎癥反應(yīng)。miR-125b主要參與細(xì)胞的增殖分化、凋亡等生理過(guò)程，在腫瘤的形成與發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要功能［22］。Priyanka 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b通過(guò)靶向調(diào)控Line28A，參與造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞中的分化過(guò)程。Hu 等［24］發(fā)現(xiàn)miR-125b能抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)源干擾素調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，從而參與機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)；但是關(guān)于miR-125b在膿毒癥急性肺損傷中的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)建立膿毒癥急性肺損傷大鼠模型發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)照組大鼠，miR-125b的相對(duì)表達(dá)水平在LPS腹腔注射的第4、8、12、24 h后均明顯降低，提示miR-125b在急性肺損傷大鼠肺組織中的表達(dá)顯著降低；而TNF-α 與IL-6 的表達(dá)則顯著升高；實(shí)驗(yàn)組miR-125b的表達(dá)水平與TNF-α、IL-6表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)，表明隨著miR-125b表達(dá)的降低，細(xì)胞內(nèi)源TNF-α 與IL-6 的表達(dá)顯著升高。在巨噬細(xì)胞NR8383細(xì)胞株中加入LPS誘導(dǎo)后的不同時(shí)間段，細(xì)胞內(nèi)源miR-125b的表達(dá)水平較對(duì)照組均下調(diào)，TNF-α、IL-6的表達(dá)水平上升；這與Hu等［24］研究相似，提示膿毒血癥導(dǎo)致的急性肺損傷中，miR-125b低表達(dá)可上調(diào)炎癥相關(guān)調(diào)節(jié)因子，參與肺部炎癥反應(yīng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，降低NR8383細(xì)胞內(nèi)源miR-125b的表達(dá)時(shí)，Notch1 表達(dá)水平升高，而當(dāng)提高NR8383 細(xì)胞內(nèi)源miR-125b的表達(dá)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)源Notch1蛋白表達(dá)水平下降，表明miR-125b可能通過(guò)靶向調(diào)控Notch1蛋白的表達(dá)，抑制TNF-α與IL-6的表達(dá)。

綜上所述，在膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中，miR-125b的表達(dá)水平顯著降低，而相關(guān)炎癥因子，如TNF-α與IL-6的表達(dá)則顯著升高，提示三者均參與了體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；在膿毒癥急性肺損傷大鼠肺組織中，miR-125b可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)源靶基因Notch1 蛋白的表達(dá)，從而抑制TNF-α 與IL-6 的表達(dá)，負(fù)向調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，有利于抑制膿毒癥急性肺損傷的進(jìn)一步發(fā)生，這為臨床治療膿毒癥急性肺損傷提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

Fig.1 HE staining results of lung tissues in five groups of rats（×400）圖1 各組大鼠模型肺組織HE染色結(jié)果（×400）