李璨，陸爽，吳君

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝組織受多種自身或外界環(huán)境刺激引起慢性炎性損傷后進行的病理性自身修復過程，肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。近30年來，國內(nèi)外學者致力于研究直接作用HSC進行抗肝纖維化的靶點。研究顯示，在CCl4或化學毒物所致的肝纖維化模型中，wnt/β-catenin 通路與HSC的活化及肝纖維化形成存在一定的關(guān)系［1-2］。Dickkopf-1（DKK1）作為wnt 蛋白的抑制因子，可抑制該通路激活，具有改善組織纖維化的作用［3］，但目前wnt/β-catenin通路在免疫性肝纖維化大鼠模型中的作用機制尚少見報道。免疫性肝纖維化模型常用豬血清進行誘導，該方法經(jīng)濟簡捷、肝纖維化形成率高、對動物損傷輕微，且與人類慢性病毒性肝炎導致的肝纖維化在發(fā)病機制上接近。復方鱉甲軟肝片是目前臨床上常用的抗肝纖維化效果較好的一類藥物，其機制與抑制HSC增殖，減少膠原合成并沉積于Diss 間隙有關(guān)［4］。丹防膠囊是由丹參、黃芪、漢防己、熟大黃、銀杏葉、土鱉、鱉甲、龜板及三七組成的復方制劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹防膠囊對大鼠免疫性肝纖維化有一定的干預作用［5］。因此，本研究采用豬血清誘導建立大鼠免疫性肝纖維化模型，以復方鱉甲軟肝片為陽性對照藥，檢測各組大鼠肝組織wnt1、β-catenin、DKK1 的表達，進一步探討丹防膠囊對大鼠免疫性肝纖維化干預作用的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及藥物 60 只清潔級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供（SYXK 黔2015-0001）；丹防膠囊（貴州省貴陽天陽生物技術(shù)有限公司，自制復方制劑未申報為新藥）；復方鱉甲軟肝片（內(nèi)蒙古中蒙藥科技公司），丹防膠囊和復方鱉甲軟肝片均與蒸餾水按1∶10 混合制成溶液給藥。本研究獲得貴州醫(yī)科大學倫理委員會批準（1402050）。

1.1.2 主要試劑及儀器 無菌豬血清（北京燕生政博公司，141105）；wnt1 抗體（Abcam，ab85060）；β-catenin 抗體（Abcam，ab32572）；DKK1 抗體（Abcam，ab109416）；GAPDH抗體（Cell Signaling，14C10）；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ZB-2301）；總RNA 提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，Dp 419］；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（TAKARA BIO INC，RR047A）；TB Green premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH plus，TAKARA BIO INC，RR820A）；qPCR引物（武漢天一輝遠生物科技有限公司）；羥脯氨酸（HYP）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A030-2）；SDS-PAGE 微型凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國BIO-RAD 公司）；ChemiScope5300一體式化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學儀器有限公司）；熒光定量PCR 儀ViiA 7 Dx（Life technologies）；核酸測定儀Nanodrop 2000（Thermo scientific）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及處理 60只清潔級SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法均分為6組：正常組、模型組、陽性藥物組、低劑量丹防膠囊組（低丹組）、中劑量丹防膠囊組（中丹組）、高劑量丹防膠囊組（高丹組），每組10 只。除正常組外，其余各組大鼠均腹腔注射無菌豬血清0.5 mL建立大鼠免疫性肝纖維化模型，正常組腹腔注射生理鹽水0.5 mL，每周2次。造模同時，低、中、高丹組每天分別給予丹防膠囊0.54、2.16、4.32 g/kg灌胃，陽性藥物組給予復方鱉甲軟肝片0.54 g/kg灌胃，正常組與模型組給予等量生理鹽水灌胃，共12周［5］。第12周初隨機處死模型組大鼠2只，行蘇木素-伊紅（HE）染色，若均符合肝纖維化程度3～4 級病理組織學改變，則顯示造模成功。實驗第1周，低丹組和中丹組因灌胃操作失誤各死亡1只大鼠；實驗第5周，模型組因肺部出現(xiàn)出血灶致1只大鼠死亡。12周末行麻醉處死大鼠，取各組大鼠肝右葉相同部位肝組織，一部分肝組織經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋用于HE染色和免疫組織化學染色；剩余新鮮組織置于-80 ℃冰箱保存用于后續(xù)實驗。

1.2.2 堿水解法檢測各組大鼠肝組織HYP 含量 取各組大鼠肝右葉相同部位肝組織稱濕重，并嚴格按試劑盒操作要求檢測HYP含量。

1.2.3 HE 染色 取各組大鼠肝右葉相同部位肝組織，常規(guī)石蠟包埋，制作為4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯脫蠟及不同濃度乙醇水化后，行HE染色，40倍光鏡下觀察肝組織病理學改變。

1.2.4 免疫組化染色檢測肝組織wnt1、β-catenin、DKK1蛋白的表達 肝組織石蠟包埋后切成4 μm厚的切片，經(jīng)脫蠟、水化及抗原修復后孵育一抗wnt1（1∶200）、β-catenin（1∶100）、DKK1（1∶100），4 ℃過夜。二抗37 ℃孵育30 min，經(jīng)DAB 顯色、復染、返藍、中性樹膠封片。顯微鏡下每張切片隨機選取4個高倍鏡視野（×400）觀察定位，以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色為wnt1、β-catenin 陽性細胞，細胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色染色為DKK1陽性細胞，并利用Image J計算平均光密度（OD）值。

1.2.5 Western blot 檢測肝組織wnt1、β-catenin、DKK1 蛋白的表達 稱取約40 mg 肝組織，加入1 mL 裂解液，采用超聲波震碎法置于冰上操作進行勻漿，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，吸取上清移入干凈EP管內(nèi)，運用BCA法測定蛋白濃度，使各管蛋白濃度一致，隨后按4∶1 加入5×SDS Loding buffer，100 ℃金屬浴加熱10 min 變性。蛋白樣品每孔上樣量約80 μg進行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉4 h。結(jié)束后加入一抗wnt1（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000）、DKK1（1∶2 000）、GAPDH（1∶6 000）4 ℃冰箱孵育過夜。次日加入HRP標記的二抗（1∶5 000），常溫孵育50 min，洗膜并曝光，以GAPDH 為內(nèi)參照，利用Image J 對各組蛋白條帶進行灰度值分析。

1.2.6 qPCR 檢測肝組織wnt1、β-catenin、DKK1 基因的表達 稱取約50 mg肝組織，按照總RNA提取試劑盒說明書操作提取總RNA。采用Nanodrop 2000 測定A260/A280并記錄RNA 樣品的濃度及純度。采用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser對RNA樣品進行逆轉(zhuǎn)錄。按PCR操作說明書在ViiA 7 Dx PCR儀器上進行實時定量PCR操作。PCR反應(yīng)體系為2 μL 上下游引物混合物（各1 μL）、1.6 μL cDNA、10 μL SYBR、0.4 μL ROX Ⅱ、6 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，每組樣本設(shè)置3 個復孔，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織HYP 含量比較 與正常組比較，模型組及低、中丹組HYP含量增多（P＜0.05）；與模型組比較，低丹組HYP 含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中、高丹組HYP 含量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，低、中丹組HYP 含量增多（P＜0.05），高丹組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；低、中、高丹組HYP含量依次降低，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1。

Fig.1 HYP contents in liver tissues of rats圖1 大鼠肝臟組織HYP含量

2.2 肝組織病理學改變 正常組肝組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肝組織中未見膠原纖維增生；模型組可見廣泛肝組織破壞，肝索排列紊亂，匯管區(qū)可見膠原纖維增生，部分區(qū)域有假小葉形成；與模型組比較，低丹組肝纖維化程度無明顯改善，中、高丹組肝纖維化程度明顯減輕；與陽性藥物組比較，低、中丹組纖維化程度嚴重，而高丹組纖維化最輕且與其差異不大；低、中、高丹組中肝纖維化程度逐漸減輕，其中高丹組肝纖維化改善最明顯。見圖2。

2.3 免疫組化染色檢測大鼠肝組織wnt1、βcatenin、DKK1 蛋白的表達 wnt1、β-catenin 定位于細胞質(zhì)，正常肝組織有少量表達甚至不表達；DKK1定位于細胞核，正常肝組織中大量表達。與正常組比較，模型組及低、中丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平升高，DKK1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中、高丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平降低，DKK1蛋白表達水平升高（P＜0.05），低丹組差異無統(tǒng)計學意義；與陽性對照組比較，低、中丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平升高，DKK1蛋白表達水平降低（P＜0.05），高丹組差異無統(tǒng)計學意義；低、中、高丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平依次降低，DKK1 蛋白表達水平依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2、圖3。

2.4 Western blot 檢測大鼠肝組織wnt1、β-catenin、DKK1蛋白的表達 與正常組比較，模型組及低、中丹組wnt1、β-catenin蛋白表達水平升高，DKK1蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中、高丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平降低，DKK1蛋白表達水平升高（P＜0.05），低丹組差異無統(tǒng)計學意義；與陽性藥物組比較，低、中丹組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平升高，DKK1蛋白表達水平降低（P＜0.05），高丹組差異無統(tǒng)計學意義；低、中、高丹組wnt1、βcatenin 蛋白表達水平依次降低，DKK1 蛋白表達水平依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3、圖4。

Tab.2 Expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in rat liver tissues表2 大鼠肝組織中wnt1、β-catenin、DKK1的表達（OD值，±s）

Tab.2 Expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in rat liver tissues表2 大鼠肝組織中wnt1、β-catenin、DKK1的表達（OD值，±s）

＊P＜0.05；a 與正常組比較，b 與模型組比較，c 與陽性藥物組比較，d與低丹組比較，e與中丹組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性藥物組低丹組中丹組高丹組F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 15.87±5.38 73.71±5.37a 18.91±2.90 64.99±4.92ac 32.38±5.75abcd 17.60±3.65bde 495.19＊β-catenin 14.75±3.37 42.19±8.81a 17.12±2.54 31.83±8.89ac 18.86±2.32abcd 17.33±2.45bde 9.00＊DKK1 43.49±8.11 18.99±2.26a 33.79±4.05 22.00±1.03ac 29.25±2.09abcd 35.46±4.85bde 10.22＊

Tab.3 The protein expression levels of wnt1,β-catenin and DKK in rat liver表3 大鼠肝組織中wnt1、β-catenin、DKK1的蛋白表達水平（±s）

Tab.3 The protein expression levels of wnt1,β-catenin and DKK in rat liver表3 大鼠肝組織中wnt1、β-catenin、DKK1的蛋白表達水平（±s）

＊P＜0.05；a 與正常組比較，b 與模型組比較，c 與陽性藥物組比較，d與低丹組比較，e與中丹組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性藥物組低丹組中丹組高丹組F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 0.43±0.12 1.56±0.19a 0.68±0.15 1.22±0.12ac 0.90±0.13abcd 0.51±0.15bde 26.71＊β-catenin 0.63±0.04 1.44±0.18a 0.52±0.15 1.36±0.09ac 0.97±0.13abcd 0.71±0.07bde 22.52＊DKK1 1.48±0.14 0.76±0.24a 1.31±0.11 1.01±0.24ac 1.08±0.18abcd 1.29±0.10bde 6.08＊

Fig.4 Western blot results of protein expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in rat liver tissues圖4 Western blot檢測大鼠肝組織wnt1、β-catenin、DKK1蛋白表達

2.5 qPCR 檢測大鼠肝組織wnt1、β-catenin、DKK1 mRNA的表達 與正常組比較，模型組及低、中丹組wnt1、β-catenin mRNA 表達水平升高，DKK1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，中、高丹組wnt1、β-catenin mRNA 表達水平降低，DKK1 mRNA表達水平升高（P＜0.05），低丹組差異無統(tǒng)計學意義；與陽性對照組比較，低、中丹組wnt1、β-catenin mRNA 表達水平升高，DKK1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05），高丹組差異無統(tǒng)計學意義；低、中、高丹組wnt1、β-catenin mRNA 表達水平依次降低，DKK1 mRNA 表達水平依次升高，組間多重比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

Tab.4 Expression levels of wnt1,β-catenin and DKK1 mRNA in rat liver表4 大鼠肝組織內(nèi)wnt1、β-catenin、DKK1 mRNA表達水平（±s）

Tab.4 Expression levels of wnt1,β-catenin and DKK1 mRNA in rat liver表4 大鼠肝組織內(nèi)wnt1、β-catenin、DKK1 mRNA表達水平（±s）

＊P＜0.05；a 與正常組比較，b 與模型組比較，c 與陽性藥物組比較，d與低丹組比較，e與中丹組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性藥物組低丹組中丹組高丹組F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 mRNA 0.28±0.07 1.00±0.00a 0.39±0.08 0.70±0.17ac 0.58±0.16abcd 0.33±0.08bde 36.49＊β-catenin mRNA 0.40±0.23 1.00±0.00a 0.51±0.06 0.66±0.24ac 0.57±0.14abcd 0.46±0.07bde 11.55＊DKK1 mRNA 2.95±0.30 1.00±0.00a 2.37±0.30 1.35±0.16ac 1.59±0.22abcd 2.59±0.28bde 53.20＊

3 討論

HSC 作為肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，多條信號通路可通過活化HSC 導致肝纖維化的發(fā)生。其中，wnt 信號通路與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系［6-8］。有研究表明，在HSC中，通過抑制wnt通路激活可抑制HSC 的活化，起抗肝纖維化的作用［9］。由丹參、黃芪、漢防己、熟大黃、銀杏葉、土鱉、鱉甲、龜板及三七組成的丹防膠囊，其包含的藥物單方均被證實有較好的抗纖維化效果［10-13］。前期研究發(fā)現(xiàn)丹防膠囊可能對大鼠HSC 細胞的增殖有抑制作用［14］。本研究在此基礎(chǔ)上，進一步驗證丹防膠囊對肝纖維化的干預作用，并探討其作用機制是否與wnt/βcatenin通路相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織實質(zhì)大部分被破壞，肝細胞排列紊亂，匯管區(qū)內(nèi)有膠原纖維形成，呈條索狀向肝小葉放射并破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，甚至出現(xiàn)假小葉，HYP含量最高，表明豬血清誘導的大鼠免疫性肝纖維化模型建立成功。與模型組比較，低劑量丹防膠囊組肝纖維化程度及HYP 含量無明顯變化，但中、高劑量丹防膠囊組肝纖維化程度及HYP含量明顯減輕，其中高劑量丹防膠囊組較中劑量丹防膠囊組變化更明顯，提示丹防膠囊對大鼠免疫性肝纖維化有一定的干預作用，并呈劑量相關(guān)性。經(jīng)高劑量丹防膠囊和復方鱉甲軟肝片干預后的肝組織，其肝纖維化程度、HYP 含量無明顯差異，提示在本實驗條件下高劑量丹防膠囊的療效與復方鱉甲軟肝片類似。結(jié)合前期研究結(jié)果［5］表明，中、高劑量的丹防膠囊可對免疫性肝纖維化起保護作用，但尚需在其他因素（如CCl4、復合因素等）所致的大鼠肝纖維化模型中進一步驗證。

Huang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型中，模型組wnt1、β-catenin 的表達水平高于正常組，經(jīng)干預后wnt1、β-catenin 的表達水平下降，wnt/β-catenin 通路激活被抑制，進一步抑制HSC 的活化，減少膠原纖維分泌，達到改善肝纖維化的效果。DKK1是wnt家族的一類抑制因子，在肝、腹膜、胰腺等器官纖維化中均被證實可通過抑制wnt通路改善器官纖維化［16-18］，但目前DKK1 在免疫性肝纖維化中的作用尚少見報道。本研究免疫組化染色結(jié)果顯示，與模型組相比，低劑量丹防膠囊組wnt1、βcatenin、DKK1 蛋白表達水平無明顯差異；然而，中、高劑量丹防膠囊組wnt1、β-catenin 蛋白表達水平降低，DKK1蛋白表達水平升高。Western blot 及qPCR結(jié)果顯示，wnt1、β-catenin、DKK1蛋白與mRNA表達水平的變化與免疫組化染色結(jié)果一致。提示丹防膠囊可以影響wnt/β-catenin通路的表達，本研究認為，丹防膠囊對大鼠免疫性肝纖維化的干預作用可能是通過上調(diào)DKK1 表達，降低wnt1、β-catenin 表達，從而影響wnt/β-catenin通路激活有關(guān)。同時低劑量丹防膠囊并未激活wnt/β-catenin 通路，這也解釋了其未能改善小鼠肝纖維化的原因，亦證實了上述推論。

綜上所述，丹防膠囊對大鼠免疫性肝纖維化起保護作用，其機制可能是通過上調(diào)DKK1表達，降低wnt1、β-catenin 表達，抑制wnt/β-catenin 通路激活，從而改善大鼠免疫性肝纖維化。本研究證實了wnt/β-catenin 通路與肝纖維化的相關(guān)性，進一步探究了丹防膠囊改善肝纖維化可能的潛在機制，為抗肝纖維化治療提供新的思路和方向。

Fig.2 Comparison of pathological results of rat liver tissue(HE staining，×40)圖2 大鼠肝組織病理結(jié)果比較（HE染色，×40）

Fig.3 Expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in liver tissues(IHC staining，×400)圖3 大鼠肝組織wnt1、β-catenin、DKK1蛋白的表達（免疫組化染色，×400）