方 群，何東軍，張 全，賀文杰，王 婷，葉 靜

（成都醫(yī)學院藥學院，四川 成都610500）

適量飲酒具有促進血液循環(huán)、疏通經(jīng)脈、助氣健胃、散濕止痛等功效。但隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展和人際交往的增加，嗜酒人群所占比例上升，酒精所引發(fā)的疾病和問題也日益嚴重。研究表明人體短期內(nèi)大量飲酒容易導致急性酒精中毒，從而出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等各種不適癥狀，急性酒精中毒己經(jīng)成為節(jié)假日發(fā)病率最高的疾病之一[1]。目前，開發(fā)安全、高效的抗醉解酒制品，并研究其作用機理受到廣泛重視。

二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）為藤茶中主要的黃酮類化合物,近年來其藥理作用受到廣泛關(guān)注。既往研究證實二氫楊梅素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物及調(diào)血脂等多方面的藥理作用。此外,二氫楊梅素還具有解除乙醇中毒，預防酒精肝、脂肪肝等作用[2-4]。為此，本文對二氫楊梅素的解酒作用進行研究，為研發(fā)新的預防酒精中毒的藥物提供一定的參考。

1 實驗材料

1.1 試劑

二氫楊梅素原料藥（批號：20160226，武漢東康源科技）；二甲基亞砜（批號：20170103，天津市瑞金特化學品有限公司）。肝素鈉（日本sigma 公司）；甲醇（色譜純，美國MREDA 公司）；其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 儀器

氣相色譜儀（Agilent 7980B）；頂空進樣器（Agilent 7697A）；壓蓋器；色譜柱（agilent J&W GC Columns，美國Agilent 公司）；電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）；UPT 純水儀（優(yōu)普超純科技公司）；BS 224S 電子天平（德國Sartorius）；KH220 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗動物

健康SD 大鼠，SPF 級，♂，3.5 月齡，體質(zhì)量240～300 g，購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川）2016-15]。在溫度（25±2）℃自然光照射下自由進食和飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 DMY 混懸液的配制

精密稱取適量DMY 原料藥，加入適量DMSO使溶解，并用生理鹽水稀釋，配成終濃度為5 mg·mL-1的混懸液待用。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent 19091J-413:HP-5(30m×320um×0.25um) 毛細管色譜柱；進口樣溫度：200℃；檢測器氫焰離子化檢測儀（FID）溫度：200℃；載氣：氮氣，流速12 mL·min-1恒速；分流比：10∶1；升溫程序：起始溫度40℃，恒溫5 min 后，以26.4℃/min 直至升到250℃。頂空瓶溫度：85℃加熱平衡15min，LOOP 管溫度：85℃，TR.LINE 溫度：100℃，進樣時間：0.5min。

2.3 方法學研究

2.3.1 專屬性實驗

取蒸餾水0.49mL 于頂空瓶中，加入80mg·ml-1乙醇水溶液10μL，最終得1.6mg·mL-1乙醇溶液，為陽性對照組；取空白血漿0.49mL 于頂空瓶中，加入蒸餾水10μL，為陰性對照組；取灌胃酒精后60min 時收集的大鼠血漿作為供試品；將陰性對照樣品和供試品按照“2.2”項下色譜條件進行測定，得相應(yīng)樣品的色譜圖（圖1）。由圖1 可知，在已建立的檢測方法中，酒精的保留時間為0.52min，分離度好，無其它內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。

圖1 氣相色譜圖

2.3.2 標準曲線制備

取空白血漿0.49mL 分別加入濃度為80mg·mL-1，40mg·mL-1、20mg·mL-1、10mg·mL-1、5mg·mL-1、1mg·mL-1的乙醇水溶液標準系列溶液10 μL，配成一系列濃度的血漿-乙醇樣品，然后條件按照“2.2”項下色譜條件進行測定，每一濃度進行3 樣本分析，記錄色譜圖。以測得的峰面積（Y）為縱坐標，以血中酒精濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為Y=5449.6 X-32.34（r=0.9996），血液中酒精濃度在0.02～1.6 mg·mL-1范圍內(nèi)時，濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好，符合定量分析要求。

2.3.3 精密度

取10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 分別加入0.49mL 血漿中，得濃度分別為0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-10.8mg·mL-1的低、中、高濃度血漿乙醇溶液，按“2.2”項下色譜條件頂空進樣進行測定，1d 內(nèi)重復測定5 次，計算日內(nèi)RSD。各濃度一周內(nèi)重復測定3 次，計算日間精密度。日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表1所示。高、中、低3 濃度的日內(nèi)RSD 分別為2.71%、6.53%、0.94%；日間RSD 分別為2.34%、5.30%、2.14%，血中乙醇的日內(nèi)和日間精密度良好。

表1 血中乙醇的日內(nèi)和日間精密度

2.3.4 回收率實驗

將加樣供試品測得的峰面積帶入標準曲線方程計算測得濃度，以測得量和加入量濃度之比計算方法回收率。

分 別 取 濃 度 為10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 與0.49ml 血漿混合，得0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.8mg·mL-1的低、中、高濃度的乙醇血漿樣品，照“2.2”項下色譜條件測得其峰面積。將所測得的峰面積值代入回歸方程，計算得乙醇水溶液的測得濃度，以測得濃度與配置濃度之比計算相對回收率?；厥章式Y(jié)果如表2 所示。高、中、低3 濃度的乙醇相對回收率在90%～110%范圍內(nèi)，符合生物樣品含量測定的要求。

表2 乙醇血漿溶液的回收率(n=3)

2.3.5 穩(wěn)定性實驗

配制高、中、低三個濃度的乙醇血漿溶液，各配6 份，分別在常溫下放置0、4、8、12h 和4℃下保存0、1、3 d 后進行測定后進行測定。不同溫度下短期和長期保存條件下乙醇在血漿中的穩(wěn)定性用RSD 表示，結(jié)果見表3。高、中、低3濃度的RSD 均＜8%，說明米托蒽醌在上述保存條件下穩(wěn)定。

2.4 大鼠血中乙醇濃度的測定

取雄性SD 大鼠12 只，隨機分為兩組。實驗組先以20mL/kg 劑量灌胃5mg/mL DMY 混懸液，2h 后給予50%乙醇（0.16mL/10g）；對照組先灌胃20mL/kg 的生理鹽水，2h 后給予50%酒精（0.16mL/10g）。實驗前禁食12 h，不禁水，分別在灌胃后5min、30min、60min，90min、180min、270min 于尾靜脈采取血樣0.3mL 至1.5 mL 肝素化的離心管，并轉(zhuǎn)移至20mL 頂空瓶中。血漿樣本按建立的乙醇檢測方法進樣測定，并計算血中乙醇含量。以時間為橫坐標，血中乙醇濃度為縱坐標作圖，結(jié)果如圖2 所示。

表3 大鼠血漿中乙醇的穩(wěn)定性（n=3）

圖2 血中乙醇濃度-時間曲線圖

由圖2 可知，DMY 混懸組大鼠體內(nèi)酒精含量低于對照組，說明二氫楊梅素能降低大鼠體內(nèi)酒精含量，具有一定的解酒作用。

3 討論和總結(jié)

作者參考文獻[5]通過對氣相升溫程序進行調(diào)試，當起始溫度為40℃，恒溫5 min 后，以26.4℃/min直至升到250℃，主峰保留時間適宜，峰型較好，且與雜質(zhì)能很好地分離。該法簡單，靈敏，專屬性強，能夠很好的測定血中乙醇的濃度。

本研究采用了目前常用的大鼠醉酒模型，因考慮到灌服乙醇致醉后影響藥物的服用問題，所以實驗過程中全部采用了先灌服DMY 混懸液，后灌服乙醇溶液的方式，實驗結(jié)果很大程度上體現(xiàn)了DMY 的防醉功效。本文雖然證實了二氫楊梅素可以降低大鼠血中乙醇濃度，但缺乏對其機理的研究，建議下一步研究二氫楊梅素對乙醇吸收的影響，并對小鼠肝臟中ADH、ALDH、SOD、GSH—Px 的酶活力的影響，從而進一步闡明二氫楊梅素解酒的機理。