方 群,何東軍,張 全,賀文杰,王 婷,葉 靜
(成都醫(yī)學院藥學院,四川 成都610500)
適量飲酒具有促進血液循環(huán)、疏通經(jīng)脈、助氣健胃、散濕止痛等功效。但隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展和人際交往的增加,嗜酒人群所占比例上升,酒精所引發(fā)的疾病和問題也日益嚴重。研究表明人體短期內(nèi)大量飲酒容易導致急性酒精中毒,從而出現(xiàn)頭暈、惡心、嘔吐等各種不適癥狀,急性酒精中毒己經(jīng)成為節(jié)假日發(fā)病率最高的疾病之一[1]。目前,開發(fā)安全、高效的抗醉解酒制品,并研究其作用機理受到廣泛重視。
二氫楊梅素(Dihydromyricetin,DMY)為藤茶中主要的黃酮類化合物,近年來其藥理作用受到廣泛關(guān)注。既往研究證實二氫楊梅素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物及調(diào)血脂等多方面的藥理作用。此外,二氫楊梅素還具有解除乙醇中毒,預防酒精肝、脂肪肝等作用[2-4]。為此,本文對二氫楊梅素的解酒作用進行研究,為研發(fā)新的預防酒精中毒的藥物提供一定的參考。
二氫楊梅素原料藥(批號:20160226,武漢東康源科技);二甲基亞砜(批號:20170103,天津市瑞金特化學品有限公司)。肝素鈉(日本sigma 公司);甲醇(色譜純,美國MREDA 公司);其他試劑均為分析純,水為屈臣氏蒸餾水。
氣相色譜儀(Agilent 7980B);頂空進樣器(Agilent 7697A);壓蓋器;色譜柱(agilent J&W GC Columns,美國Agilent 公司);電熱鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司);UPT 純水儀(優(yōu)普超純科技公司);BS 224S 電子天平(德國Sartorius);KH220 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。
健康SD 大鼠,SPF 級,♂,3.5 月齡,體質(zhì)量240~300 g,購自四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2016-15]。在溫度(25±2)℃自然光照射下自由進食和飲水。
精密稱取適量DMY 原料藥,加入適量DMSO使溶解,并用生理鹽水稀釋,配成終濃度為5 mg·mL-1的混懸液待用。
色譜柱:Agilent 19091J-413:HP-5(30m×320um×0.25um) 毛細管色譜柱;進口樣溫度:200℃;檢測器氫焰離子化檢測儀(FID)溫度:200℃;載氣:氮氣,流速12 mL·min-1恒速;分流比:10∶1;升溫程序:起始溫度40℃,恒溫5 min 后,以26.4℃/min 直至升到250℃。頂空瓶溫度:85℃加熱平衡15min,LOOP 管溫度:85℃,TR.LINE 溫度:100℃,進樣時間:0.5min。
2.3.1 專屬性實驗
取蒸餾水0.49mL 于頂空瓶中,加入80mg·ml-1乙醇水溶液10μL,最終得1.6mg·mL-1乙醇溶液,為陽性對照組;取空白血漿0.49mL 于頂空瓶中,加入蒸餾水10μL,為陰性對照組;取灌胃酒精后60min 時收集的大鼠血漿作為供試品;將陰性對照樣品和供試品按照“2.2”項下色譜條件進行測定,得相應(yīng)樣品的色譜圖(圖1)。由圖1 可知,在已建立的檢測方法中,酒精的保留時間為0.52min,分離度好,無其它內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。
圖1 氣相色譜圖
2.3.2 標準曲線制備
取空白血漿0.49mL 分別加入濃度為80mg·mL-1,40mg·mL-1、20mg·mL-1、10mg·mL-1、5mg·mL-1、1mg·mL-1的乙醇水溶液標準系列溶液10 μL,配成一系列濃度的血漿-乙醇樣品,然后條件按照“2.2”項下色譜條件進行測定,每一濃度進行3 樣本分析,記錄色譜圖。以測得的峰面積(Y)為縱坐標,以血中酒精濃度(X)為橫坐標,繪制標準曲線。得回歸方程為Y=5449.6 X-32.34(r=0.9996),血液中酒精濃度在0.02~1.6 mg·mL-1范圍內(nèi)時,濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好,符合定量分析要求。
2.3.3 精密度
取10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 分別加入0.49mL 血漿中,得濃度分別為0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-10.8mg·mL-1的低、中、高濃度血漿乙醇溶液,按“2.2”項下色譜條件頂空進樣進行測定,1d 內(nèi)重復測定5 次,計算日內(nèi)RSD。各濃度一周內(nèi)重復測定3 次,計算日間精密度。日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表1所示。高、中、低3 濃度的日內(nèi)RSD 分別為2.71%、6.53%、0.94%;日間RSD 分別為2.34%、5.30%、2.14%,血中乙醇的日內(nèi)和日間精密度良好。
表1 血中乙醇的日內(nèi)和日間精密度
2.3.4 回收率實驗
將加樣供試品測得的峰面積帶入標準曲線方程計算測得濃度,以測得量和加入量濃度之比計算方法回收率。
分 別 取 濃 度 為10mg·mL-1、20mg·mL-1、40mg·mL-1乙醇水溶液10μL 與0.49ml 血漿混合,得0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1、0.8mg·mL-1的低、中、高濃度的乙醇血漿樣品,照“2.2”項下色譜條件測得其峰面積。將所測得的峰面積值代入回歸方程,計算得乙醇水溶液的測得濃度,以測得濃度與配置濃度之比計算相對回收率?;厥章式Y(jié)果如表2 所示。高、中、低3 濃度的乙醇相對回收率在90%~110%范圍內(nèi),符合生物樣品含量測定的要求。
表2 乙醇血漿溶液的回收率(n=3)
2.3.5 穩(wěn)定性實驗
配制高、中、低三個濃度的乙醇血漿溶液,各配6 份,分別在常溫下放置0、4、8、12h 和4℃下保存0、1、3 d 后進行測定后進行測定。不同溫度下短期和長期保存條件下乙醇在血漿中的穩(wěn)定性用RSD 表示,結(jié)果見表3。高、中、低3濃度的RSD 均<8%,說明米托蒽醌在上述保存條件下穩(wěn)定。
取雄性SD 大鼠12 只,隨機分為兩組。實驗組先以20mL/kg 劑量灌胃5mg/mL DMY 混懸液,2h 后給予50%乙醇(0.16mL/10g);對照組先灌胃20mL/kg 的生理鹽水,2h 后給予50%酒精(0.16mL/10g)。實驗前禁食12 h,不禁水,分別在灌胃后5min、30min、60min,90min、180min、270min 于尾靜脈采取血樣0.3mL 至1.5 mL 肝素化的離心管,并轉(zhuǎn)移至20mL 頂空瓶中。血漿樣本按建立的乙醇檢測方法進樣測定,并計算血中乙醇含量。以時間為橫坐標,血中乙醇濃度為縱坐標作圖,結(jié)果如圖2 所示。
表3 大鼠血漿中乙醇的穩(wěn)定性(n=3)
圖2 血中乙醇濃度-時間曲線圖
由圖2 可知,DMY 混懸組大鼠體內(nèi)酒精含量低于對照組,說明二氫楊梅素能降低大鼠體內(nèi)酒精含量,具有一定的解酒作用。
作者參考文獻[5]通過對氣相升溫程序進行調(diào)試,當起始溫度為40℃,恒溫5 min 后,以26.4℃/min直至升到250℃,主峰保留時間適宜,峰型較好,且與雜質(zhì)能很好地分離。該法簡單,靈敏,專屬性強,能夠很好的測定血中乙醇的濃度。
本研究采用了目前常用的大鼠醉酒模型,因考慮到灌服乙醇致醉后影響藥物的服用問題,所以實驗過程中全部采用了先灌服DMY 混懸液,后灌服乙醇溶液的方式,實驗結(jié)果很大程度上體現(xiàn)了DMY 的防醉功效。本文雖然證實了二氫楊梅素可以降低大鼠血中乙醇濃度,但缺乏對其機理的研究,建議下一步研究二氫楊梅素對乙醇吸收的影響,并對小鼠肝臟中ADH、ALDH、SOD、GSH—Px 的酶活力的影響,從而進一步闡明二氫楊梅素解酒的機理。