鄧同興， 王敏麗， 溫文靜， 袁 磊△

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部， 河南 漯河 462002； 2漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院兒科， 河南 漯河 462300)

肺癌是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。全世界每年肺癌的發(fā)病人數(shù)與死亡人數(shù)約為186萬例和160萬例[1]。在中國，男性肺癌患者的發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第1位，女性肺癌患者的發(fā)病率居第2位，死亡率位居首位[2]。由于多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)已為晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)，臨床治療以放療和化療為主。盡管大多數(shù)肺癌患者對初始化療敏感，但化療的毒副作用較強(qiáng)且易出現(xiàn)耐藥性，二線化療效果不佳[3]。因此，從天然植物化學(xué)成分中尋找安全有效的新型抗腫瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)。毛蘭素(erianin)是一種從蘭科石斛屬植物鐵皮石斛和鼓槌石斛中分離得到的聯(lián)芐類化合物，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌和抗前列腺增生等多種藥理作用[4]。近年研究表明，毛蘭素可通過誘導(dǎo)凋亡、抑制增殖、阻礙侵襲和轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤血管生成發(fā)揮抗腫瘤活性[4-7]。但毛蘭素對人肺癌細(xì)胞是否具有抑制作用尚未見報(bào)道。本項(xiàng)工作探討毛蘭素對人肺癌A549細(xì)胞活力和凋亡的影響，并初步分析其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌A549細(xì)胞和人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)液購自HyClone；毛蘭素購自中國食品藥品檢定研究院；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)抑制劑SB203580(SB)和抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)購自Sigma； CCK-8試劑盒、RIPA裂解液、TRIzol、Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、NAD(P)H:醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase-1，NQO1]、血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)、p38 MAPK、p-p38 MAPK(T180/Y182)、caspase-3、cleaved caspase-3和β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌A549細(xì)胞和人正常支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞用含10 % FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5 % CO2條件下中進(jìn)行培養(yǎng)；每2～3 d按1∶3的比例傳代1次。

2.2藥物配制 將毛蘭素溶于二甲基亞砜(dime-thyl sulfoxide, DMSO)制成10 mmol/L儲(chǔ)備液，分裝后于-20 ℃儲(chǔ)存。使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液將儲(chǔ)備液稀釋成至所需濃度，其中DMSO終濃度為0.1%[8]；對照(control)組使用含有0.1% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活性 取對生長期細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h；去上清，實(shí)驗(yàn)孔加入100 μL含不同濃度(10、20、40、80和160 nmol/L)毛蘭素的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)對照孔和調(diào)零孔，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔；處理48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%。采用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算毛蘭素對A549細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，分別用0、20、40和80 nmol/L毛蘭素處理A549細(xì)胞48 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌3次，用Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞；加入Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，輕輕混勻，4 ℃避光孵育15 min；使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)分析檢測細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS含量 細(xì)胞分組同2.4，收集各組細(xì)胞，用PBS洗滌3次，用含10 μmol/L DCFH-DA的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37 ℃孵育20 min； PBS洗滌3次，將細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)液中，使用流式細(xì)胞儀檢測各試驗(yàn)樣本的熒光強(qiáng)度，以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)代表ROS含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6SOD活性和MDA含量檢測 細(xì)胞分組同2.4，收集細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度；采用WST-8法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，按照各自說明書方法和操作要求進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7Western blot法檢測蛋白水平 取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，分別用不同劑量(0、20、40和80 nmol/L)毛蘭素、毛蘭素(80 nmol/L)+SB(10 μmol/L)或毛蘭素(80 nmol/L)+NAC(5 nmol/L)處理48 h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度；蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用脫脂奶粉封閉1 h，加入抗Nrf2、NQO1、HO-1、p38 MAPK、p-p38 MAPK、caspase-3、cleaved caspase-3和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入II抗(1 ∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照；使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度值的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 毛蘭素對A549細(xì)胞和BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，不同劑量毛蘭素組A549細(xì)胞活力均顯著下降(P<0.05)，且隨著毛蘭素劑量的增加，A549細(xì)胞活力呈下降趨勢，IC50為52.64 nmol/L；但不同劑量毛蘭素組BEAS-2B細(xì)胞活力與對照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1. The effect of erianin on the viability of A549 cells and BEAS-2B cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs20 nmol/L group;△P<0.05vs40 nmol/L group.

圖1 毛蘭素對A549和BEAS-2B細(xì)胞活力的影響

2 毛蘭素對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40和80 nmmol/L毛蘭素組A549細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，且各劑量組間細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

3 毛蘭素對A549細(xì)胞中ROS含量的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40和80 nmol/L毛蘭素組MFI均顯著升高(P<0.05)，且各劑量組間MFI的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The effect of erianin on apoptosis of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs20 nmol/L group;△P<0.05vs40 nmol/L group.

圖2 毛蘭素對A549細(xì)胞凋亡的影響

4 毛蘭素對A549細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的影響

WST-8法和硫代巴比妥酸法結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40和80 mmol/L毛蘭素組SOD活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，且各劑量組間SOD活性和MDA含量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

5 毛蘭素對Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，20、40和80 mmol/L毛蘭素組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，且各劑量組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

Figure 3. The effect of erianin on ROS level in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs20 nmol/L group;△P<0.05vs40 nmol/L group.

圖3 毛蘭素對A549細(xì)胞中ROS含量的影響

Figure 4. The effect of erianin on SOD acitivity and MDA content in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs20 nmol/L group;△P<0.05vs40 nmol/L group.

圖4 毛蘭素對A549細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的影響

6 毛蘭素對p-p38 MAPK和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，80 mmol/L 毛蘭素組p38 MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白的活化水平均顯著升高(P<0.05)；與80 mmol/L 毛蘭素組相比，毛蘭素(80 nmol/L)+SB(10 μmol/L)組和毛蘭素(80 nmol/L)+NAC(5 nmol/L)組p38蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白的活化水平均顯著降低(P<0.05)，見圖6。

討 論

毛蘭素是從石斛中提取的一種天然化合物，近年研究顯示，毛蘭素具有顯著的抗腫瘤活性。目前報(bào)道的毛蘭素抗腫瘤作用與多個(gè)信號通路相關(guān)，這包括通過線粒體途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；通過激活ROS/JNK信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期期阻滯、凋亡和自噬，通過阻斷JAK2/STAT3信號通路抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和血管生成等[4-7]。本研究表明，在體外毛蘭素可劑量依賴性地抑制人肺癌A549細(xì)胞活力，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

Wang等[6]研究證實(shí)，毛蘭素可通過蓄積ROS誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。過多的ROS可氧化胞膜磷脂形成穩(wěn)定的MDA，因此MDA是脂質(zhì)過氧化損傷的標(biāo)志物之一[9]。本研究也表明，毛蘭素可劑量依賴性地提高A549細(xì)胞中ROS和MDA含量，而NAC可抑制毛蘭素引起的caspase-3活化，這提示氧化應(yīng)激反應(yīng)可能是毛蘭素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。SOD是細(xì)胞清除ROS的主要酶類之一。Tyagi等[10]證實(shí)，增加細(xì)胞內(nèi)SOD含量可減輕ROS蓄積導(dǎo)致的A549細(xì)胞凋亡。本研究表明，毛蘭素可劑量依賴性地降低A549細(xì)胞中SOD活性，這可能抑制A549細(xì)胞對ROS的清除能力，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。

Figure 5. The effect of erianin on protein levels of Nrf2, NQO1 and HO-1 in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L group;#P<0.05vs20 nmol/L group;△P<0.05vs40 nmol/L group.

圖5 毛蘭素對A549細(xì)胞中Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. The effect of erianin on activation of p38 MAPK and caspase-3 in A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol nmol/L group;#P<0.05vserianin group.

圖6 毛蘭素對A549細(xì)胞中p38 MAPK蛋白磷酸化和caspase-3蛋白活化的影響

Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵分子，通過與靶基因的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，調(diào)控多種抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，如NQO1和HO-1等[11-12]。研究證實(shí)，Nrf2敲除會(huì)下調(diào)A549細(xì)胞中NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平，并導(dǎo)致A549細(xì)胞中ROS水平升高[13-14]。Madajewski等[15]證實(shí)，采用shRNA沉默NQO1基因可升高A549細(xì)胞中ROS水平。Kang等[16]表明，沉默HO-1基因也可導(dǎo)致A549細(xì)胞中ROS水平升高。本研究顯示，毛蘭素可劑量依賴地下調(diào)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平，這提示毛蘭素可能通過抑制Nrf2/ARE通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

ROS可通過激活MAPK激酶和抑制MAPK磷酸酶等多種途徑導(dǎo)致p38 MAPK的持續(xù)活化[17-19]。p38 MAPK在ROS誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。ROS可通過激活p38 MAPK上調(diào)胃癌A549細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，引起胞質(zhì)中細(xì)胞色素C水平升高，觸發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡[20]。Shin等[21]顯示，p38 MAPK抑制劑SB203580可阻斷ROS引發(fā)的A549細(xì)胞凋亡。本研究表明，毛蘭素可活化A549細(xì)胞中p38 MAPK和caspase-3，該作用可被NAC和SB203580抑制，這表明毛蘭素可通過激活ROS/p38 MAPK通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

由于采用體外實(shí)驗(yàn)方法，本研究尚存在不足和局限性。但已有研究證實(shí)，毛蘭素在動(dòng)物體內(nèi)仍具有顯著的抗腫瘤作用。Wang等[6]向正常雌性BALB/c裸小鼠的脛骨內(nèi)注射人骨肉瘤143B細(xì)胞建立原位骨肉瘤移植瘤模型，隔日腹腔注射毛蘭素(20 mg/kg)，14 d后結(jié)果顯示移植瘤的生長受到顯著抑制，移植瘤組織中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)以及cleaved caspase-3和磷酸化JNK的蛋白水平均顯著升高，而增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的蛋白水平顯著降低，且未對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、腎、脾和肺等臟器產(chǎn)生顯著的毒性作用。該項(xiàng)研究表明，在體內(nèi)外毛蘭素可能通過相同的機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤活性。

綜上所述，毛蘭素可在體外誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，這可能與其抑制SOD活性，下調(diào)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)，繼而導(dǎo)致ROS含量升高和激活p38信號通路有關(guān)。