吳海英， 吳元庭， 陳優(yōu)優(yōu)， 駱惠麗， 蔣慧芳

(浙江省立同德醫(yī)院血液科， 浙江 杭州 310012)

急性白血病(acute leukemia，AL)是早期造血前體細(xì)胞突變導(dǎo)致的造血系統(tǒng)惡性腫瘤。我國(guó)急性白血病發(fā)病率約為6～7人/10萬人口，約占腫瘤總發(fā)病率的5%。近年來，對(duì)白血病的治療取得了很大的進(jìn)展，在傳統(tǒng)化療基礎(chǔ)上，高危患者選擇骨髓移植，另外靶向治療、細(xì)胞免疫治療以及CAR-T等療法在急性白血病領(lǐng)域得到飛躍性發(fā)展[1-3]。盡管如此，因疾病的異質(zhì)性、化療或靶向治療所致的毒副反應(yīng)及其耐藥性等仍是尚未解決的難題，許多患者在確診后的生存期僅數(shù)月。因此，急性白血病的治療對(duì)每一個(gè)臨床醫(yī)生來說仍是一個(gè)任重道遠(yuǎn)的任務(wù)，需要我們進(jìn)一步探討新的治療手段。

中醫(yī)中藥是我國(guó)的寶貴資源，如來自中藥的砷劑在急性早幼粒白血病中運(yùn)用和高三尖杉酯堿治療急性髓系白血病都是極為成功的例子，說明研究抗白血病的中藥具有重要意義。三葉青為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤(Tetrastigmahemsleyanum，TH)，現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物是中藥三葉青抗腫瘤主要成分之一。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)三葉青黃酮(RadixTetrastigmahemsleyaniflavone，RTHF)主要通過提高機(jī)體免疫力及調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等途徑達(dá)到抗腫瘤作用。RTHF對(duì)急性白血病細(xì)胞的研究目前尚未見報(bào)道。本文觀察RTHF對(duì)白血病NB-4細(xì)胞株的活力及凋亡的影響，并通過對(duì)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路的調(diào)控，來揭示RTHF抑制白血病細(xì)胞活力及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，為今后使之成為抗白血病的中藥新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB-4細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。先把DMSO溶解成高濃度的母液4.5 g/mL，然后用PBS稀釋100倍，再進(jìn)行細(xì)胞加藥處理，保證細(xì)胞里的終濃度DMSO<0.1%。

2 主要試劑與儀器

RTHF購(gòu)自西安金綠生物公司；CCK-8 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；BrdU試劑盒購(gòu)自BioVision；周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京嘉美生物公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；抗Bcl-2、細(xì)胞色素C (cytochrome C，Cyt-C)、caspase-3、磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2)、p-p38、磷酸化的c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)和p-ERK5 等多種抗體均購(gòu)自Affinity；ERK5抑制劑購(gòu)自Sigma；HRP 標(biāo)記的 II 抗購(gòu)自碧云天公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)；電泳儀和電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的NB-4細(xì)胞復(fù)蘇后，加入DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，放入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)NB-4細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，傳代培養(yǎng)。

3.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分4組：(1)空白對(duì)照(control)組：加入等體積的DMSO；(2)RTHF 低劑量(0.25 g/L)組；(3)RTHF 中劑量(0.5 g/L)組；(4) RTHF 高劑量(1 g/L)組。上述不同濃度的RTHF分別處理24、48和72 h。

3.3CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入上述各組RTHF處理24、48和72 h，對(duì)照組加等體積DMSO。向每孔加入10 μL CCK-8反應(yīng)液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度(A)值。

3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 分別將低、中和高劑量RTHF加入NB-4細(xì)胞，對(duì)照組加等體積DMSO，48 h后，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清。細(xì)胞固定加入5 mL預(yù)冷的70%乙醇，混勻后4 ℃固定4 h或過夜。取出固定好的細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清。樣品中加入0.5 mL細(xì)胞周期染色液，輕輕混勻吹散細(xì)胞，37 ℃避光染色20 min，即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)紅光通道熒光信號(hào)，采用分析軟件進(jìn)行周期擬合分析。

3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 低、中和高劑量RTHF處理NB-4細(xì)胞48 h，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清。 加入300 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞； annexin V-FITC標(biāo)記(加入5 μL的annexin V-FITC混勻)后，避光，室溫孵育15 min；PI標(biāo)記(再加入10 μL的PI染色)，輕輕混勻細(xì)胞，于避光條件下室溫孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)。

3.6BrdU摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)照組合低、中和高劑量RTHF處理NB-4的細(xì)胞，同時(shí)各孔加入30 μmol/L BrdU，細(xì)胞培養(yǎng)48 h，1 500 r/min離心5 min，洗滌細(xì)胞，棄上清。加入0.5 mL的2 mol/L HCl/0.5% Triton X-100，室溫孵育30 min；用50 μL的0.5% Tween 20/1% BSA/PBS重懸，加入10～20 μL (1 μg/106cells) α-BrdU (mAb) 結(jié)合摻入的BrdU，室溫孵育1 h；重懸后，加入 II 抗5 μL (1 μg/106cells)，室溫、避光孵育30 min。離心棄上清，加入10 μL PI工作液，室溫、避光孵育30 min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.7Western blot檢測(cè)蛋白水平 收獲各組藥物處理后細(xì)胞離心，棄上清。每孔加入100 μL RIPA(含PMSF)細(xì)胞裂解液，渦旋混勻；12 000 r/min離心15 min，取上清為細(xì)胞總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白，配制10%分離膠10 mL及6%濃縮膠5 mL，將凝膠置于電泳槽中，加入電泳緩沖液，每孔加上樣液15 μL。先用80 V恒壓電泳，約20 min，當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后改用110 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，100V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h。10%脫脂奶粉封閉，孵育 I 抗Bax、Bcl-2、Cyt-C、caspase-3(1 ∶1 000)、p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-ERK5(1∶1 000)和GAPDH(1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，HRP標(biāo)記的 II 抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。暗室中用X膠片顯影和定影。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17統(tǒng)計(jì)處理軟件分析。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RTHF對(duì)急性髓系白血病NB-4細(xì)胞活力及增殖的影響

低、中和高劑量RTHF分別處理NB-4細(xì)胞24、48和72 h，采用CCK-8法檢測(cè)，結(jié)果顯示，NB-4細(xì)胞活力均受到明顯抑制(P<0.01)，IC50分別為4.74、2.26和1.34 g/L，見圖1A。BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中和高劑量的RTHF處理48 h后，NB-4細(xì)胞的增殖率均明顯下降(P<0.01),見圖1B。這提示RTHF可抑制NB-4細(xì)胞的活力和增殖。

Figure 1. Effects of RTHF on the viability (A) and proliferation (B) of NB-4 cells detected by CCK-8 assay and BrdU test. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 g/L group.

圖1 RTHF對(duì)NB-4細(xì)胞活力和增殖的影響

2 RTHF阻滯細(xì)胞增殖周期的作用

采用流式細(xì)胞術(shù)分析RTHF對(duì)細(xì)胞周期的影響，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量RTHF處理NB-4細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示，G2期細(xì)胞比例均明顯增多(P<0.05)，而S期細(xì)胞比例則顯著下降(P<0.05)，見圖2。這提示RTHF能夠阻滯NB-4細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，停滯在G2期。

Figure 2. The effect of RTHF on the cell cycle distribution of NB-4 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 g/L group.

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同劑量RTHF對(duì)NB-4細(xì)胞周期分布的影響

3 RTHF誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V/PI染色檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量RTHF處理細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率均顯著增加(P<0.01)，見圖3。

Figure 3. The effect of RTHF on the apoptosis of NB-4 cells analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 g/L group.

圖3 Annexin V檢測(cè)RTHF誘導(dǎo)NB-4細(xì)胞凋亡的作用

4 Western blot分析RTHF對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低、中和高劑量RTHF處理的NB-4細(xì)胞，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，而Bax、caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)則明顯升高，呈濃度依賴性(P<0.01)，見圖4。提示RTHF能夠促進(jìn)NB-4細(xì)胞凋亡，且濃度越高，促進(jìn)作用越明顯。

Figure 4. The effect of RTHF on apoptosis-related protein levels determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 g/L group.

圖4 Western blot分析RTHF對(duì)凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

5 RTHF對(duì)NB-4細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、中和高劑量RTHF值NB-4細(xì)胞中p-p38的蛋白水平明顯升高，且隨著濃度升高，作用更為明顯；而p-ERK5蛋白水平則明顯降低，并呈劑量依賴性(P<0.05)。此外，p-ERK1/2和p-JNK的蛋白水平均無明顯變化，見圖5。這提示RTHF可通過提高p38的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其功能活性，并通過降低ERK5的磷酸化而抑制其功能活性；但對(duì)ERK1/2和JNK的磷酸化狀態(tài)無明顯影響。

Figure 5. The protein levels of MAPK signaling pathway-related molecules in the NB-4 cells determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 g/L group.

圖5 Western blot檢測(cè)不同劑量組對(duì)NB-4細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白水平的影響

討 論

急性白血病在化療、造血干細(xì)胞移植和細(xì)胞免疫等治療手段下，其死亡率仍然較高[4]。因此，很有必要尋找新的綜合治療方式。黃酮類化合物是由苯丙氨酸合成的植物色素，在綠色植物細(xì)胞中普遍存在，其能夠抑制特定的酶，模擬一些激素和神經(jīng)遞質(zhì)以及清除自由基。有研究表明黃酮類化合物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖，因此它具有抗腫瘤活性[5]，但是其抗腫瘤機(jī)制還未完全闡明[6-7]。

近年來RTHF的抗腫瘤作用越來越受關(guān)注，我們課題組觀察RTHF對(duì)肝癌細(xì)胞HepG-2及原代大鼠肝細(xì)胞體外毒性作用研究，證實(shí)其毒性很低，即對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制效應(yīng)明顯，而對(duì)大鼠正常肝細(xì)胞無明顯損傷作用。同時(shí)，探討了RTHF抗實(shí)體瘤的量-效關(guān)系，揭示其抗腫瘤的作用機(jī)制與誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡相關(guān)。本研究其結(jié)果提示：(1)RTHF能夠有效地抑制NB4細(xì)胞的活力，其作用通過阻滯細(xì)胞增殖周期而阻滯于G2期，呈時(shí)間劑量依賴性；(2)RTHF能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，annexin V檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞比例明顯增高；并下調(diào)抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3和Cyt-C的表達(dá)，均呈劑量依賴性；(3)RTHF抑制磷酸化的ERK5蛋白激酶，促進(jìn) p38蛋白激酶的磷酸化，但對(duì)ERK1和JNK單薄激酶的磷酸化無明顯影響。

人MAPK級(jí)聯(lián)有4個(gè)主要的MAPKs，包括ERK1/2、JNK、p38和大MAP激酶1(BMK1/ERK5)。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控，尤其是在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中起著關(guān)鍵作用，且其中很多MAPK成員與血液系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系密切。例如，在急慢性白血病中，ERK通路中MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是Raf/Mek/ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，利妥昔單抗誘導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡是p38依賴性的，發(fā)現(xiàn)p38及其下游效應(yīng)子MAPKAPK-2在用抗CD20分離的CLL細(xì)胞培養(yǎng)過程中被激活，而用p38藥理學(xué)抑制劑SB203580處理導(dǎo)致誘導(dǎo)惡性淋巴細(xì)胞凋亡。

本文結(jié)果提示通過RTHF能夠降低磷酸化的ERK5而抑制其功能活性。ERK5蛋白與細(xì)胞存活、抗凋亡信號(hào)、血管生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分化和細(xì)胞增殖有關(guān)[8]，如在體外實(shí)驗(yàn)中，高表達(dá)ERK5的前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)，在體內(nèi)更有效地形成腫瘤，反之亦然[9]。ERK5對(duì)于表達(dá)bcr/abl融合基因的白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)也是必需的[10]。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)ERK5蛋白具有調(diào)控單核細(xì)胞分化的作用，在髓系白血病這種分化調(diào)控受阻礙，導(dǎo)致白血病細(xì)胞分化障礙。抑制ERK5本身的磷酸化功能激活狀態(tài)，則抑制AML細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，停滯在G2期[12]，本文結(jié)果提示RTHF可具有抑制ERK5蛋白及其磷酸化的作用。

p38 MAPK家族成員是由4組分子量為38 kD蛋白組成，可分為α、β、γ和δ。這四者之間大概有60%相同的氨基酸序列，基于此，p38 MAPK家族成員有重疊的底物特異性，雖然有些差異已經(jīng)被報(bào)道，例如對(duì)于特定的底物p38α和p38β比p38γ和p38δ能更好地磷酸化，反之亦然。p38是一個(gè)促炎因子，但同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與存活[13]。p38 MAPK通路在細(xì)胞凋亡過程中對(duì)caspase的上游和下游均起作用，因此既參與細(xì)胞增殖、分化，也參與細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果顯示，RTHF能夠上調(diào)磷酸化的P38蛋白表達(dá)，提示RTHF可通過提高p38的磷酸化狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)其功能活性，推測(cè)可能與RTHF誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡相關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

第1個(gè)JNK也被稱為應(yīng)激激活蛋白激酶(stress-activated protein kinase,SAPK)，有1～3種不同亞型，每種亞型分布不同，主要參與細(xì)胞增殖與生長(zhǎng)的調(diào)控。ERK1/2蛋白激酶在細(xì)胞增殖、分化及存活等起重要作用，在癌癥中常可見到ERK1/2蛋白的異常，ERKs的活性取決于RAS和RAF激酶的突變。本文實(shí)驗(yàn)未見到RTHF對(duì)磷酸化JNK和ERK1/2蛋白激酶的影響。由此，我們推測(cè)，RTHF抑制急性早幼粒細(xì)胞白血病NB-4細(xì)胞增殖的作用，與JNK和ERK1/2蛋白的磷酸化及其信號(hào)傳遞的關(guān)系不大[14-15]。

最近的研究表明[16]，全反式維甲酸通過作用于 JNK/p38 MAPK信號(hào)通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷,而全反式維甲酸正是誘導(dǎo)早幼粒細(xì)胞分化的重要藥物。由此，我們推測(cè)，三葉青黃酮在進(jìn)行MAPKs通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)能起到相似的作用,當(dāng)然，這還需要我們進(jìn)一步的研究。

綜上所述，RTHF對(duì)白血病NB-4細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)、加速凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過可通過凋亡蛋白途徑，并由MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)通路中的ERK5及p38途徑起信號(hào)傳導(dǎo)作用。