任曉暉， 王洪波， 郭 慶， 趙 娜

(濰坊市益都中心醫(yī)院耳鼻咽喉科， 山東 濰坊 262500)

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮的腫瘤，具有不易早期診斷、生長(zhǎng)隱匿、較早發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，給人類(lèi)的生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。鼻咽癌的發(fā)生與遺傳因素、環(huán)境因素和EB病毒感染等因素有關(guān)，且生成涉及到多個(gè)基因及信號(hào)通路的改變，抑癌基因失活、癌基因激活及它們之間的相互作用失衡是鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制[2]。因此，研究與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因及信號(hào)途徑尤為重要。三結(jié)構(gòu)域蛋白(tripartite motif-containing protein，TRIM)是一個(gè)結(jié)構(gòu)較為保守且進(jìn)化快速的蛋白家族，與細(xì)胞增殖、凋亡和分化等生物學(xué)行為密切相關(guān)。TRIM29是TRIM家族成員之一；近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在多種腫瘤中TRIM29異常表達(dá)[3-4]。鼻咽癌中TRIM29呈現(xiàn)高表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[5]；也有研究表明，抑制TRIM29表達(dá)可降低鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移[6]。但關(guān)于TRIM29對(duì)鼻咽癌凋亡的影響及機(jī)制尚未明確。因此，本研究以人鼻咽癌細(xì)胞系5-8F為研究對(duì)象，觀察RNA干擾(RNA interfering，RNAi)抑制TRIM29表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，以期為鼻咽癌的診療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及主要試劑和儀器

人鼻咽癌細(xì)胞系5-8F購(gòu)自ATCC。RPMI-1640培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000均購(gòu)自Invitrogen；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；陰性對(duì)照siRNA及TRIM29siRNA購(gòu)自上海吉瑪；BCA試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天；細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自江蘇凱基；抗TRIM29、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、t-AKT和p-AKT抗體均購(gòu)自Abcam。FACScalibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自BD；iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 5-8F細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，使用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種細(xì)胞于含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基的6孔板，每孔2 mL(約5×105細(xì)胞)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染日能夠達(dá)到90%融合度。參照LipofectamineTM2000制備Lipo 2000-siRNA復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板，輕柔來(lái)回?fù)u晃培養(yǎng)板使之混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育4～5 h，更換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行轉(zhuǎn)染后的其他檢測(cè)步驟。實(shí)驗(yàn)分為空白(blank)組、陰性對(duì)照(negative control，NC)組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA)和si-TRIM29組(轉(zhuǎn)染TRIM29的特異性siRNA)。siRNA序列(僅列出正義鏈)為5’-GAGCUGCGCAAGUCCAUUUTT-3’。NC序列(僅列出正義鏈)為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

2.2siRNA干擾TRIM29表達(dá)效率的檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-TRIM29后的5-8F細(xì)胞的TRIM29蛋白表達(dá)，簡(jiǎn)要步驟如下：適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，蛋白樣品加上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性10 min，按照每孔50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE，電泳后電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，使用麗春紅染膜證實(shí)蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫條件將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，洗膜，將TRIM29(1∶500稀釋)和內(nèi)參照GAPDH(1∶1 000稀釋)抗體孵育液加入至孵育盒，4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，將1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 II 抗覆蓋在膜上，室溫孵育1 h，洗膜，ECL顯色，Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度值掃描分析，以目的蛋白與內(nèi)參照灰度值比值為蛋白相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，參照上述方法檢測(cè)各組細(xì)胞cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、t-AKT和p-AKT的蛋白水平。

2.3CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活力 將轉(zhuǎn)染siRNA后的5-8F細(xì)胞以每孔3×103接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，每孔中加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染siRNA 48 h的細(xì)胞，離心，去掉上清液，適量預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加Annexin V-FITC和PI各5 μL，避光室溫孵育15～20 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

10 μmol/L的 PI3K/AKT信號(hào)通路特異性抑制劑LY294002及si-TRIM29單獨(dú)或聯(lián)用處理5-8F細(xì)胞，細(xì)胞分為空白組、LY294002組和LY294002+si-TRIM29組，3組細(xì)胞處理48 h，方法同上檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA干擾效率檢測(cè)結(jié)果

空白組和NC組比較，TRIM29蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，而與空白組比較,轉(zhuǎn)染TRIM29siRNA后TRIM29蛋白的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The effect of siRNA targetingTRIM29gene on the protein expression of TRIM29 in the 5-8F cells after transfection. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖1 轉(zhuǎn)染靶向TRIM29基因的siRNA后抑制5-8F細(xì)胞TRIM29蛋白的表達(dá)

2 沉默TRIM29表達(dá)抑制5-8F細(xì)胞的活力

CCK-8法檢測(cè)TRIM29siRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞后的細(xì)胞活力情況，結(jié)果顯示，自TRIM29siRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞48 h起，細(xì)胞活力均明顯降低，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

3 沉默TRIM29表達(dá)促進(jìn)5-8F細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)的各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，空白組、NC組和si-TRIM29組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.27±0.29)%、(4.17±0.31)%和(23.57±2.26)%，其整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=212.431，P=0.000)。與空白組比較，沉默TRIM29基因表達(dá)后5-8F細(xì)胞的凋亡率明顯增加，(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2. The effect of transfection of siRNA targetingTRIM29gene on the viability of the 5-8F cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2 轉(zhuǎn)染TRIM29基因siRNA對(duì)5-8F細(xì)胞活力的影響

4 沉默TRIM29表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

靶向TRIM29的siRNA轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞48 h，通過(guò)Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)的caspase家族cleaved caspase-3/-9及Bcl-2家族Bcl-2和Bax的蛋白水平，結(jié)果顯示，和空白組比較，si-TRIM29 組cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平明顯升高，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 沉默TRIM29表達(dá)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路t-AKT和p-AKT的蛋白水平，結(jié)果顯示，與空白組比較，si-TRIM29 組p-AKT蛋白的水平明顯降低(P<0.05)，3組間t-AKT蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(F=0.104，P>0.05)，見(jiàn)圖5。

6 沉默TRIM29表達(dá)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)5-8F細(xì)胞凋亡

10 μmol/L的 LY294002及si-TRIM29單獨(dú)或聯(lián)用處理5-8F細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組、LY294002組和LY294002+si-TRIM29組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.27±0.33)%、(17.77±1.02)%和(35.97±2.87)%，其整體比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=242.651，P=0.000)。LY294002組的細(xì)胞凋亡率明顯高于空白組，而LY294002+si-TRIM29組的細(xì)胞凋亡率明顯高于LY294002組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

TRIM家族蛋白是生命活動(dòng)中一類(lèi)非常重要的蛋白，與腫瘤、細(xì)胞凋亡和病毒應(yīng)答等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。TRIM29是TRIM家族成員之一，其基因定位于人類(lèi)染色體11q23。有研究表明，TRIM29可參與細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等多種生物學(xué)過(guò)程[9]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，TRIM29與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其在不同腫瘤中可能作用不同，有研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌和多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤中TRIM29呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[10-11]，而在前列腺癌和乳腺癌等腫瘤中則下調(diào)表達(dá)[12-13]，以上研究提示TRIM29基因具有抑癌基因樣和癌基因樣作用。

Figure 3. The effect of siRNA targetingTRIM29gene on the apoptosis of 5-8F cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖3 轉(zhuǎn)染TRIM29基因siRNA對(duì)5-8F細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect ofTRIM29expression silencing on the expression of apoptosis related proteins in the 5-8F cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖4 沉默TRIM29表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 5. The effect ofTRIM29expression silencing on PI3K/AKT signaling in the 5-8F cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖5 沉默TRIM29表達(dá)對(duì)5-8F細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

Figure 6. Silencing ofTRIM29gene expression and inhibition of PI3K/AKT signaling both induced apoptosis in the 5-8F cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsLY294002 group.

圖6 沉默TRIM29可抑制PI3K/AKT信號(hào)誘導(dǎo)5-8F細(xì)胞凋亡

RNAi是一種生物學(xué)上由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，在各種物種中廣泛存在，具有特異性、高效性和易操作等特點(diǎn)，在基因治療、基因功能研究、尋找信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新途徑等方面廣泛應(yīng)用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，用siRNA敲減TRIM29基因的表達(dá)可抑制NCI-H520肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并增強(qiáng)順鉑化療敏感性[15]；RNAi敲減TRIM29表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]；RNAi敲減TRIM29表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌增殖、侵襲及EMT[17]，以上研究結(jié)果提示，敲減TRIM29表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)。有研究顯示，抑制TRIM29可降低鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移能力[6]，本研究旨在觀察沉默TRIM29表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)將靶向TRIM29的siRNA轉(zhuǎn)染鼻咽癌5-8F細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TRIM29表達(dá)被抑制后的5-8F細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、侵襲遷移、分化和血管生成等多種功能的調(diào)節(jié)，AKT是PI3K/AKT信號(hào)核心，AKT的活化可通過(guò)磷酸化激活或抑制激酶、轉(zhuǎn)移因子等下游效應(yīng)分子，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[18]。有研究表明，在包括鼻咽癌的多種腫瘤中可檢測(cè)到p-AKT信號(hào)表達(dá)升高，且p-AKT高表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[19]。TRIM29可通過(guò)PTEN/AKT/mTOR信號(hào)促進(jìn)鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移[20]。本研究結(jié)果顯示，敲減TRIM29表達(dá)可下調(diào)p-AKT的蛋白水平，提示敲減TRIM29表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)促進(jìn)鼻咽癌凋亡。LY294002是黃酮類(lèi)衍生物，是強(qiáng)效的PI3K抑制劑，可與PI3K競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ATP位點(diǎn)。有研究顯示，LY294002可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[21]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)LY294002可抑制鼻咽癌凋亡，且可增加沉默TRIM29對(duì)鼻咽癌的誘導(dǎo)作用，說(shuō)明敲減TRIM29表達(dá)可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

Bcl-2、Bax和caspase-3均為細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白。Bcl-2和Bax均為Bcl-2家族成員，發(fā)揮抗凋亡作用和促凋亡作用；caspase-3為caspase家族的關(guān)鍵酶，也是凋亡執(zhí)行者。Bcl-2和Bax蛋白定于線粒體上游，是改變線粒體膜通透性的重要調(diào)控因素，Bcl-2和Bax均可作為caspase-3的上游調(diào)控基因介導(dǎo)細(xì)胞存活和凋亡[22]。有研究顯示，抑制P13K/AKT信號(hào)通路可上調(diào)鼻咽癌cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax的蛋白水平，下調(diào)Bcl-2表達(dá)[23]。本研究結(jié)果顯示，敲減TRIM29表達(dá)可上調(diào)鼻咽癌cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，提示敲減TRIM29表達(dá)對(duì)鼻咽癌凋亡的作用方式與調(diào)節(jié)cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax和Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，RNA干擾沉默鼻咽癌細(xì)胞TRIM29表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，機(jī)制與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。本研究為T(mén)RIM29在鼻咽癌中的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，提示TRIM29可能是鼻咽癌分子靶向治療的一個(gè)新的靶標(biāo)，但還需更多研究理論及臨床實(shí)踐支持。