陳文慧， 何曉華， 張 鼎， 陳 嬙， 趙建夫， 徐 萌

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科， 廣東 廣州 510632)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是發(fā)病具有明顯地域聚集性的惡性腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全球約80%的鼻咽癌發(fā)生在中國，其中華南及香港地區(qū)高發(fā)，因此鼻咽癌又被稱為“廣東瘤”[1-2]。鼻咽癌病理類型多為對放射線敏感度高的低分化鱗狀細(xì)胞癌(WHO 分型的未分化型和分化型非角化性癌)，因此采取放射治療為主的綜合治療，其局控率及總生存率得到顯著提高，但仍有20%左右的患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展導(dǎo)致治療失敗[2-3]。鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，與多種基因的調(diào)控密切相關(guān)，需要進(jìn)一步深入研究。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)屬于非編碼RNA家族，是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過 200 nt的RNA分子。研究表明，lncRNA參與染色體印跡、及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白功能調(diào)節(jié)等眾多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。HOX轉(zhuǎn)錄本反義RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)有反式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄作用、并影響其他染色體上基因轉(zhuǎn)錄的lncRNA，HOTAIR過度表達(dá)與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[6-8]。目前，研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中顯著高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，與總生存期和無病生存期呈明顯的負(fù)相關(guān)性[7]。Li等[9]發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達(dá)與宮頸癌的放療敏感性呈負(fù)相關(guān)。因此，HOTAIR的高表達(dá)是多種惡性腫瘤預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。調(diào)強(qiáng)放射治療(intensity-modulated radiotherapy,IMRT)是目前鼻咽癌首選的放療方式，前期發(fā)現(xiàn)HOTAIR的表達(dá)水平與鼻咽癌的無進(jìn)展生存率明顯相關(guān)，絕大部分患者是接受常規(guī)放療治療[10-11]，但在調(diào)強(qiáng)放射治療時(shí)代，HOTAIR的表達(dá)水平在鼻咽癌中的預(yù)后作用仍不清楚，同時(shí)HOTAIR表達(dá)水平在鼻咽癌的預(yù)后作用在仍然缺乏多中心驗(yàn)證。

本研究采用RT-qPCR法檢測HOTAIR在接受調(diào)強(qiáng)放射治療的鼻咽癌患者中的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證其與臨床病理特征及對預(yù)后的影響，對腫瘤精準(zhǔn)治療及預(yù)后判斷等具有重要的指導(dǎo)意義。

材 料 和 方 法

1 臨床病例資料

該研究選擇從2010年1月～2013年12月期間在暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心收治的接受調(diào)強(qiáng)放射治療鼻咽癌患者279例。患者入院時(shí)經(jīng)病理確診的非角化性鼻咽癌，未進(jìn)行放療、化療或與腫瘤相關(guān)的手術(shù)；ECOG評分：0～2分;有完整的病理送檢單及隨訪資料。279例患者中，男性220例，女性59例；中位年齡48歲。鼻咽癌的分級參照2000年世界衛(wèi)生組織(WTO)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤的分期根據(jù)2002年美國聯(lián)合委員會及國際抗癌聯(lián)盟(UICC)制定的第6版TNM分類系統(tǒng)。另選取 2018年 1月～2018年 6月在中山大學(xué)腫瘤防治中心行纖支鏡活檢的 20例患者的鼻咽癌和與之配對的癌旁正常組織新鮮標(biāo)本。本研究經(jīng)暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院和中山大學(xué)腫瘤防治中心臨床倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與者均簽署知情同意書。

2 方法

2.1RT-qPCR法檢測HOTAIR表達(dá) 按TRIzol說明書抽提組織總RNA，紫外分光光度儀測定RNA濃度并定量，按First cDNA Synthesis Kit的說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。HOTAIR的正向引物序列為5’-GGTAGAAAAAGCAACCACACGAAGC-3’，反向引物序列為5’-ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC-3’；GAPDH的正向引物序列為5’-AAGGTCATCCCTGAGCTGAA-3’，反向引物序列為5’-TGACAAAGTGGTCGTTGAGG-3’。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算HOTAIR mRNA表達(dá)水平。

2.2放射治療方式 采用同步加量(SIB)技術(shù)，劑量分割方法是每周連續(xù)照射5 d，每天1次。鼻咽、上頸部及下頸部如果采用同一IMRT計(jì)劃，靶區(qū)的照射劑量為：PTVnx：68～70Gy/30～33f；PTVnd：64～70Gy/30～33f；PTV1：60～64Gy/30～33f；PTV2：50～54Gy/30～33f。處方劑量為95%的PTV體積所接受的最低吸收劑量。

2.3療效評估和患者隨訪 隨訪內(nèi)容包括疾病無進(jìn)展生存率(pregrssion-free survival，PFS)和總生存率(overall survival，OS)。PFS定義為從鼻咽癌的確診日期至鼻咽癌出現(xiàn)首次進(jìn)展的時(shí)間(包括局部或區(qū)域復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡或刪失的最后隨訪日期)。OS定義為從鼻咽癌的確診日期至任何原因造成死亡或刪失的最后隨訪日期。患者出院后，前3年每3個(gè)月隨訪1次，3年后每6個(gè)月隨訪1次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用 chi-square test或 Fisher’s exact test 分析lncRNA HOTAIR的表達(dá)與臨床資料(包括患者的年齡、性別、腫瘤分級、TNM以及臨床分期)之間的聯(lián)系；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用log-rank test進(jìn)行單因素分析，P≤0.05值的變量納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。

結(jié) 果

1 HOTAIR在鼻咽癌組織中高表達(dá)

選取20例鼻咽癌及其配對的正常鼻咽黏膜上皮組織，RT-qPCR檢測其HOTAIR的表達(dá)。結(jié)果顯示，在75%(15/20)鼻咽癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平明顯高于正常鼻咽組織(P<0.01)，見圖1A。

為進(jìn)一步明確lncRNA HOTAIR在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平，我們采用RT-qPCR檢測HOTAIR的表達(dá)，根據(jù)ROC曲線法，對279例接受調(diào)強(qiáng)放射治療鼻咽癌組織標(biāo)本中HOTAIR的表達(dá)情況進(jìn)行分析(HOTAIR相對表達(dá)值6.05為cut-off值)，在279例鼻咽癌組織中，有59.9%(167/279)鼻咽癌組織HOTAIR表達(dá)升高(HOTAIR的相對表達(dá)量>6.05)，見圖1B、表1。

Figure 1. The expression level of HOTAIR in NPC tissues. A: RT-qPCR showed that the expression of HOTAIR in 15 cases of NPC tissues was higher than that in adjacent normal tissues; B: ROC curve analysis was employed to determine the cut-off score for overexpression of HOTAIR. The sensitivity and specificity for each clinical outcome were plotted.

圖1 HOTAIR 在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況

2 鼻咽癌組織中HOTAIR的表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

RT-qPCR法檢測279例鼻咽癌組織中的HOTAIR表達(dá)水平與患者的臨床病理特征關(guān)系，結(jié)果表明， HOTAIR的高表達(dá)與T和N分期密切相關(guān)(P<0.05)，但與患者的年齡、性別、腫瘤病理分型和M分期沒有明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

3 鼻咽癌組織中HOTAIR的表達(dá)水平與鼻咽癌患者預(yù)后的關(guān)系

將鼻咽癌組織中的HOTAIR表達(dá)水平作為因變量繪制Kaplan-Meier生存曲線， log-rank檢驗(yàn)比較鼻咽癌患者存活時(shí)間差異，結(jié)果表明HOTAIR高表達(dá)組的鼻咽癌患者與HOTAIR低表達(dá)組的鼻咽癌患者相比，PFS和OS明顯下降(P<0.05)，見圖2。單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示，HOTAIR表達(dá)情況、病理分型、T分期、N分期及M分期與鼻咽癌患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，而患者的年齡和性別與預(yù)后無顯著相關(guān)性，見表2。多變量Cox 回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HOTAIR表達(dá)水平是鼻咽癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(PFS 的HR=2.704, 95%CI為1.512～4.835,P=0.001； OS 的HR=1.958，95%CI為1.031～3.722,P=0.04)。在其它臨床病理因素中，M 分期(P=0.005) 是鼻咽癌患者無疾病進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，病理分型、N分期和M分期是鼻咽癌總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，見表3。

表1 HOTAIR表達(dá)水平與鼻咽癌臨床病理因素的關(guān)系

Table 1. Correlations between clinicopathological features and expression of HOTAIR mRNA in 279 cases of human nasopharyngeal carcinoma

CharacteristicsnHOTAIRLow expressionHigh expressionPAge at diagnosis (year)0.378 <4813559(43.7%)76(56.3%) ≥4814453(36.8%)91(63.2%)Sex0.895 Female5924(40.7%)35(59.3%) Male22088(40.0%)132(60%)Histological classification (WHO)0.374 Type II113(27.3%)8(72.7%) Type III268109(40.7%)159(59.3%)T stage0.014 T1119(81.8%)2(18.2%) T23115(48.4%)16(51.6%) T316163(39.1%)98(60.9%) T47625(32.9%)51(67.1%)N stage0.024 N04421(47.7%)23(52.3%) N111053(48.2%)57(51.8%) N29029(32.2%)61(67.8%) N3359(25.7%)26(74.3%)M stage0.194 M0254105(41.3%)149(58.7%) M1257(28.0%)18(672.0%)

Figure 2. Kaplan-Meier survival analysis indicating the correlation of HOTAIR overexpression with poorer progression-free survival (A) and overall survival (B) rates of 279 patients with NPC (log-rank test). Mean±SD.*P<0.05vslow HOTAIR group.

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析HOTAIR表達(dá)與279例鼻咽癌患者的預(yù)后

表2 單變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析279例鼻咽癌患者的不同預(yù)后參數(shù)

HR: hazard ratio; CI: confidence interval.

討 論

鼻咽癌是一種來源于鼻咽黏膜上皮的頭頸部惡性腫瘤，世界上絕大多數(shù)地區(qū)的鼻咽癌發(fā)病率很低，在1/10萬以下；但在中國發(fā)病率可達(dá)33/10萬，特別高發(fā)于我國的廣西、廣東和福建[12-13]。鼻咽癌對放射線敏感度高，因此鼻咽癌采取放射治療為主的綜合治療，調(diào)強(qiáng)放射治療是目前鼻咽癌首選的放射治療方式，順鉑同期放化療是II～VIb期鼻咽癌的標(biāo)準(zhǔn)治療手段[14]。隨著放療技術(shù)的改進(jìn)和綜合治療的廣泛應(yīng)用，其局控率及總生存率得到顯著提高，但仍有20%左右的患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展導(dǎo)致治療失敗[3, 14]。因此，在調(diào)強(qiáng)放射治療時(shí)代，尋找與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的腫瘤生物標(biāo)記物，對腫瘤精準(zhǔn)治療及預(yù)后預(yù)測具有重要的作用。

lncRNA是一組長度超過200個(gè)核苷酸的RNA，不參與編碼蛋白或只是編碼很短的多肽。近年來的研究表明，lncRNA在基因修飾過程中參與多種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控過程，主要通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄前、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和蛋白功能調(diào)節(jié)等水平實(shí)現(xiàn)對目的基因表達(dá)調(diào)控[4， 15]。lncRNAs作為一種新的重要調(diào)節(jié)因子與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15， 17]，提示其有可能成為腫瘤診斷、治療、及療效預(yù)測的生物標(biāo)志物。HOTAIR是lncRNAs家族中的一員，在乳腺癌、結(jié)直腸癌及肺癌等組織中均過表達(dá)，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良關(guān)系密切[6-7， 18-19]。有研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR高表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[18]。Gupta 等[7]研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中HOTAIR表達(dá)均升高；周越菡等[20]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR可促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病增殖并抑制其凋亡。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR的高表達(dá)與肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及肝癌細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。HOTAIR在胃癌組織中過度表達(dá)，且與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[22]。我們的結(jié)果顯示，HOTAIR在接受調(diào)強(qiáng)放射治療鼻咽癌中較鼻咽正常上皮組織表達(dá)升高；分析279例鼻咽癌組織的臨床病理特征結(jié)果顯示，有59.9%(167/279)鼻咽癌組織HOTAIR表達(dá)升高，HOTAIR的表達(dá)升高與鼻咽癌的T分期和N分期密切相關(guān)，提示HOTAIR的高表達(dá)可能與鼻咽癌的增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中，HOTAIR的表達(dá)率與M分期無明顯相關(guān)性，我們推斷是由于入組的病例數(shù)較少所造成的，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量減少偏倚。

表3 多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析279例鼻咽癌患者的不同預(yù)后參數(shù)

HR: hazard ratio; CI: confidence interval.

本研究進(jìn)一步探討鼻咽癌患者的HOTAIR和鼻咽癌患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，根據(jù) Kaplan-Meier 生存曲線，鼻咽癌患者HOTAIR表達(dá)水平升高，其5年疾病無進(jìn)展生存率和總生存率均明顯低于HOTAIR表達(dá)水平正常組。單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示，臨床病理學(xué)參數(shù)HOTAIR表達(dá)情況、病理分型、T分期、N分期及M分期與鼻咽癌患者的預(yù)后相關(guān)。根據(jù)排除以上單變量分析得出與鼻咽癌患者預(yù)后相關(guān)的因素(HOTAIR、病理分型、T分期、N分期和M分期)為協(xié)變量的可能性，我們進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HOTAIR表達(dá)水平是鼻咽癌患者無疾病進(jìn)展生存率和總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素，HOTAIR的過度表達(dá)與鼻咽癌不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果與前期Nie[10]和Zhang等[11]研究基本一致，本研究進(jìn)一步通過多中心的病例驗(yàn)證在調(diào)強(qiáng)放射治療的年代，HOTAIR的表達(dá)水平在鼻咽癌中與預(yù)后明顯相關(guān)。

綜上所述，HOTAIR在鼻咽癌患者中表達(dá)升高，且與鼻咽癌患者疾病無進(jìn)展生存率和總生存率密切相關(guān)，是預(yù)測鼻咽癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在調(diào)強(qiáng)放射治療時(shí)代，對鼻咽癌個(gè)體化治療和預(yù)后判斷有重要的意義。