密瓊潔， 韓 萍， 孫保亮， 張宗勇△

(1山東省腦微循環(huán)重點實驗室, 泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科, 山東 泰安 271016; 2臨沂市婦女兒童醫(yī)院神經(jīng)科， 山東 臨沂 276000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是一種病死率和致殘率高的腦血管疾病，主要病因是顱內(nèi)動脈瘤破裂而引起血液進入蛛網(wǎng)膜下腔。SAH后的腦損傷主要涉及神經(jīng)功能缺損、血腦屏障被破壞后通透性的增加、腦組織水腫、腦血管痙攣及細胞的壞死和凋亡等病理反應[1-3]。研究觀察，臨床SAH患者和實驗SAH模型的腦脊液中含有高濃度的谷氨酸[4-7]，過量的谷氨酸使得谷氨酸受體過度激活進而發(fā)生谷氨酸興奮性毒性，觸發(fā)鈣超載而引起腦損傷[8]。谷氨酸毒性下，位于突觸外的N-甲基-D-天冬氨酸(N-methy-D-aspartate,NMDA)受體Glun2B亞基(GluN2B-NMDA受體)引起鈣超載及神經(jīng)元死亡[9-10]。艾芬地爾(ifenprodil)是選擇性抑制GluN2B-NMDA受體的負向變構劑，能特異性地結(jié)合在受體的氨基末端結(jié)構域[11]。目前酒石酸艾芬地爾作為臨床藥物在日本和法國用于腦梗死后遺癥和腦出血后遺癥伴隨的頭暈等癥狀的改善，但該藥對SAH后腦損傷的影響，尤其是SAH后腦水腫及細胞凋亡的影響還不清楚。

本研究通過顱內(nèi)血管穿刺法制作穩(wěn)定的大鼠SAH模型，探討艾芬地爾對SAH后神經(jīng)功能缺損、血腦屏障通透性、腦水腫及皮質(zhì)細胞凋亡的影響，為臨床SAH患者的治療提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和分組

SPF級成年雄性SD大鼠(體重270～320 g，10周齡)，購買自濟南朋悅實驗動物中心，動物合格證號：SCXY(魯)20140007。飼養(yǎng)室溫23～25 ℃，相對濕度60%～65%，分籠飼養(yǎng)，環(huán)境通風良好，食物及水分按時攝入，12 h光/暗周期循環(huán)。將90只大鼠分為3組：假手術(sham)組(n=18)、 SAH+安慰劑(SAH+vehicle)組 (n=36)和SAH+ifenprodil組 (n=36)。所有動物實驗均經(jīng)泰山醫(yī)學院動物倫理委員會批準。

2 方法

2.1大鼠SAH模型制作及實驗設計 采用頸內(nèi)動脈穿刺法建立 SAH 實驗動物模型[12-13]。實驗大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 將麻醉好的大鼠仰臥固定到手術臺上，頸部用碘伏擦拭，沿頸中線剪2 cm皮膚切口，小心分離出右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動脈，電凝并切斷頸外動脈外側(cè)及內(nèi)側(cè)的2個分支后，結(jié)扎右頸總動脈近心端，右頸外動脈遠心端，并在距頸動脈分叉部5 mm處結(jié)扎頸外動脈。然后，用顯微鑷子把4-0線栓逆向插入頸總動脈進而頸內(nèi)動脈，入顱內(nèi)約18 mm而且有阻力感，再推入2～3 mm并伴隨有突破感，停留10 s，將線栓退出，以保證頸內(nèi)動脈再灌注，縫合并消毒切口。假手術組僅使得線栓至有阻力感停止，其余手術步驟與上述方法相一致。3組的死亡率如下：假手術組0%，18只均存活； SAH+安慰劑組33.3%，36只中12只死亡；SAH+ifenprodil組27.8%，36只中10只死亡。每組存活的大鼠處理如下:伊文思藍(Evans blue)法評估血腦屏障通透性實驗 (n=6)，分離腦組織用于腦水腫檢測和Western blot樣品制備 (n=6)，以及制作腦組織冰凍切片 (n=6)。

2.2SAH grade評分 SAH的嚴重程度是通過18分的SAH分級評估系統(tǒng)完成的[14]。通過Willis環(huán)及腦底部動脈分為6個節(jié)段，根據(jù)每個節(jié)段內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔出血血塊的數(shù)量，將每個節(jié)段分為0～3分。評分0:無蛛網(wǎng)膜下腔出血；評分1:少量的蛛網(wǎng)膜下腔血塊；評分2:中度的蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊但可見動脈；評分3:蛛網(wǎng)膜下腔血凝塊覆蓋所有動脈。SAH grade評分總和由所有6個節(jié)段的分數(shù)計算出來的。實驗選取12～13分的SAH模型，低于或者高于此范圍的SAH大鼠將被排除在實驗之外。

2.3腹腔注射ifenprodil 在術后2 h、24 h和48 h，腹腔注射給予安慰劑(含5% DMSO的無菌水) 或10 mg/kg ifenprodil (ab120111, Abcam；溶解于5% DMSO的無菌水)。

2.4神經(jīng)功能評分 在術后72 h, 實驗雙盲者采用Garcia神經(jīng)功能學評分評估SAH后神經(jīng)功能缺損[14]。包括6項測試：得分0～3(自主運動檢測、四肢活動檢測、前爪運動及力量)和1～3(身體的本體感覺、攀爬實驗檢測和觸覺實驗檢測), 評分通過所有6項測試的分數(shù)相加得到。評分分為3個等級：1～6分為重度神經(jīng)功能損傷，7～12分為中度神經(jīng)功能損傷，13～18分為輕度神經(jīng)功能損傷。

2.5干濕重法檢測腦水腫 在術后72 h, 通過干濕重法檢測SAH后腦水腫情況[12]。將腦組織迅速分離為左側(cè)和右側(cè)大腦半球，稱得腦組織濕重，然后于100 ℃烘箱中烘3 d，稱得干重，腦組織含水率(%)=(濕重-干重)/濕重×100% 。

2.6Evans blue法檢測血腦屏障通透性 在術后71 h, 采用伊文思藍法評估血腦屏障通透性[12]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 將麻醉好的大鼠仰臥固定到手術臺上，股靜脈注射2%伊文思藍(3.3 mL/kg)，待循環(huán)1 h后，打開胸腔，用12號針頭經(jīng)左心室插入心臟，并在右心耳處剪口，用恒流泵將60 mL 0.9%等滲鹽水灌注入心臟，行斷頭取腦，迅速分離出腦組織。精確稱量腦皮質(zhì)組織質(zhì)量，置于50%(W/V)的三氯乙酸勻漿，勻漿液與等體積的混合溶液(無水乙醇∶三氯乙酸=3∶1)置于搖床上孵育12 h，然后離心取上清液。在96孔板上，設置空白孔、對照孔、伊文思藍不同濃度孔(0、0.5、1、2、4、6、8和10 μg/L)及待測樣品孔，在酶標儀激發(fā)波長620 nm、發(fā)射波長680 nm下測定吸光度(A)值。在Excel中根據(jù)伊文思藍不同濃度對應的A值繪制標準曲線，計算出樣品中的伊文思藍含量，以假手術組的數(shù)值為標準1，得出各組伊文思藍溢出量的相對變化。

2.7TUNEL染色 在術后72 h，TUNEL染色檢測皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡[15]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 經(jīng)心臟反式灌注4%多聚甲醛后，取腦并用OCT試劑包埋，使用冰凍切片機切片(10 μm厚, 前囟開始至-3 mm)。取冠狀位腦切片，用0.1% TritonX-100破膜5 min，使用TUNEL試劑盒(#11684795910, Roche)染色90 min, 然后PBS洗滌3遍，用含有DAPI的防止熒光淬滅劑封片，然后用免疫熒光顯微鏡觀察，ImageJ軟件對圖片分析。

2.8Western blot 在術后72 h，采用Western blot檢測皮質(zhì)區(qū)Bcl-2、Bax和activated caspase-9/3表達[15]。大鼠采用10%水合氯醛麻醉(腹腔注射,4 mL/kg), 選取Willis環(huán)兩側(cè)，以分離基底皮質(zhì)組織，用蛋白質(zhì)提取試劑盒(BC3710, Solarbio)提取大腦皮質(zhì)總蛋白,然后用BCA蛋白檢測試劑盒(PC0020, Solarbio)測定蛋白濃度。SDS-PAGE分離制備好的蛋白樣品，并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用5%的脫脂牛奶進行封閉。膜分別與I抗[Bcl-2 (1∶200)和Bax (1∶200)，Santa Cruz Biotechnology； activated caspase-9 (1∶1 000)、 activated caspase-3 (1∶1 000)和β-actin (1∶1 000)，Cell signaling technology]在4 ℃下孵育過夜；TBST緩沖液洗滌膜3遍后，用抗兔或抗小鼠IgG酶聯(lián)抗體(1∶3 000)在室溫下孵育2 h，然后再用TBST緩沖液洗滌3遍，加入化學發(fā)光底物，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察蛋白條帶，ImageJ軟件對圖片分析。

3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)值以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，使用GraphPad Prism 7.0軟件通過單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析, 以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 SAH程度分級、神經(jīng)功能評分、伊文思藍溢出量及腦組織含水率

SAH后，顱底表面、Wilis環(huán)及腦干上存在顯著出血點，圖1A。在SAH grade上，SAH+安慰劑組與SAH+ifenprodil組之間沒有顯著差異(P>0.05)，見圖1A。在SAH術后72 h，SAH+安慰劑組的神經(jīng)功能分低于假手術組，說明SAH后有神經(jīng)功能的缺損，而SAH+ifenprodil組的神經(jīng)功能評分高于安慰劑組(P<0.05)，圖1B。在SAH術后72 h，假手術組伊文思藍幾乎無溢出；SAH+安慰劑組與SAH+ifenprodil組均有伊文思藍溢出，但ifenprodil組的伊文思藍含量低于安慰劑組 (P<0.05)，見圖1C。類似地，與假手術組比較，SAH+安慰劑組的大鼠左、右腦半球的腦組織含水率顯著增加 (P<0.05)， 而SAH+ifenprodil組的腦組織含水率相較于SAH+安慰劑組顯著降低(P<0.05) ，見圖1D。

2 TUNEL染色結(jié)果

在SAH 后72 h，SAH+安慰劑組基底皮質(zhì)的TUNEL陽性細胞數(shù)顯著增加，假手術組不顯著；相比SAH+安慰劑組，SAH+ifenprodil組的TUNEL陽性細胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，見圖2。

3 Bcl-2、Bax和activated caspase-9/3表達

在SAH 后72 h，與假手術組相比較，Western blot檢測顯示SAH+安慰劑組的Bcl-2水平降低，而Bax及activated caspase-3/9表達上調(diào)；與SAH+安慰劑組相比，SAH+ifenprodil組的Bcl-2表達上調(diào)，Bax及activated caspase-3/9表達下調(diào) (P<0.05),見圖3。

討 論

SAH后早期腦損傷涉及一系列病理生理的級聯(lián)反應，如炎癥反應、血腦屏障的破壞、腦水腫和細胞凋亡等，這些級聯(lián)反應與SAH后認知及運動感覺運動障礙有密切關系[16]。有研究表明，美金剛作為NMDA受體的拮抗劑，在SAH動物模型上能夠減輕SAH后的腦損傷、腦血管痙攣及神經(jīng)功能的缺損[17-18];另有研究表明，選擇性NMDA受體NB2B亞型的拮抗劑RO25-6981可使SAH后大鼠的認知功能障礙進一步加重[19]；本研究通過血管內(nèi)穿刺法制作SAH大鼠模型，觀察到SAH后有明顯的神經(jīng)功能缺損，而ifenprodil能改善SAH引起的神經(jīng)功能缺損，對于其在認知功能障礙方面的影響有待于進一步研究。Ifenprodil作為選擇性GluN2B-NMDA受體拮抗劑，能夠阻斷興奮性谷氨酸毒性導致的Ca2+大量內(nèi)流，從而起到保護神經(jīng)細胞鈣超載的作用。這可能是ifenprodil改善SAH后神經(jīng)功能缺損的原因。本研究利用伊文思藍法觀察，ifenprodil能降低SAH引起的血腦屏障通透升高。有文獻報道表明，腦血管內(nèi)皮細胞上表達NMDA受體，谷氨酸能通過激活內(nèi)皮細胞上的NMDA受體而引起內(nèi)皮細胞的完整性降低，進而引起血腦屏障破壞[20]；在SAH實驗動物模型上，NMDA受體的拮抗劑felbamate能夠減輕神經(jīng)功能缺損及血腦屏障通透升高[21]。基于文獻和本研究，我們推測SAH后谷氨酸毒性可能通過激活NMDA受體引起腦血管內(nèi)皮細胞完整性降低，而ifenprodil能夠抑制GluN2B-NMDA受體介導的鈣超載，進而保護血腦屏障。在SAH后，在早期腦損傷中存在腦組織水腫的現(xiàn)象。本研究顯示，ifenprodil可以減輕SAH后的腦水腫。有文獻報道，SAH后水通道蛋白AQP4表達升高，而且和腦水腫形成一致[22]；ifenprodil能夠下調(diào)AQP4表達[23]。我們推測ifenprodil可能抑制了SAH后AQP4的表達，而減輕SAH后腦水腫，有待于進一步實驗證實。

Figure 1. The effect of ifenprodil on neurological score, Evans Blue dye extravasation and brain water content at 72 h after SAH. A: the representative images showed rat brains in vehicle- and ifenprodil-treated SAH groups, and the bar chart showed that there was no statistical difference in SAH grading between vehicle- and ifenprodil-treated SAH groups; B, C and D: ifenprodil increased neurological score, and reduced Evans Blue dye extravasation and brain water content at 72 h after SAH. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

圖1 Ifenprodil對SAH后神經(jīng)功能評分、伊文思藍溢出量及腦組織含水率的影響

Figure 2. Ifenprodil reduced the TUNEL-positive cells in basal cortex at 72 h after SAH. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

圖2 Ifenprodil減少SAH后基底皮質(zhì)區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)

Figure 3. Ifenprodil increased the Bcl-2 expression, and decreased the Bax, activated caspase-9 and activated caspase-3 protein levels in basal cortex at 72 h after SAH. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsSAH+vehicle group.

圖3 Ifenprodil 增加SAH后Bcl-2表達，減少Bax和activated caspase-9/3蛋白表達

在SAH后，過多的谷氨酸引起的興奮性毒性導致細胞內(nèi)Ca2+和Na+的升高，進而導致線粒體功能障礙，這是突觸后神經(jīng)元凋亡的原因[24]。NMDA受體拮抗劑可以破壞谷氨酸釋放和過量受體激活之間的正反饋環(huán)路。本研究顯示，SAH后基底皮質(zhì)區(qū)存在明顯的細胞凋亡，而ifenprodil能夠減少此細胞凋亡。文獻報道，Bcl-2和Bax蛋白的構成比例是細胞凋亡調(diào)控的關鍵，當Bcl-2蛋白被抑制時，Bax形成同源二聚體而誘導細胞凋亡；當Bcl-2蛋白表達增加時，可與Bax形成異源二聚體而抑制細胞凋亡[25]。本研究顯示，SAH引起B(yǎng)cl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，這意味著Bax比例增多而誘導細胞凋亡，而ifenprodil能夠增加Bcl-2并且降低Bax表達。當Bax表達升高后，往往引起線粒體膜通透性增加，釋放線粒體色素C而引起活化caspase-9激活，隨后活化caspase-3激活，最終引起細胞凋亡。本研究觀察，ifenprodil能夠減少SAH引起的活化caspase-9/3激活，進一步證實了ifenprodil可以抑制SAH后的細胞凋亡，而發(fā)揮腦保護作用。

綜上所述，ifenprodil可能通過抑制興奮性毒性導致的GluN2B-NMDA受體過度激活來緩解SAH后早期腦損傷，表現(xiàn)在可以減輕神經(jīng)功能缺損和腦水腫，降低血腦屏障的通透性，抑制基底皮質(zhì)區(qū)細胞凋亡。本研究結(jié)果可能為酒石酸艾芬地爾臨床用于SAH的治療提供了參考資料。