張海增， 全 慧， 單曉瓊， 田秋云， 張福坤， 范小芳， 龔永生

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

尼古丁(nicotine)是煙草制品的關(guān)鍵成分，也是香煙煙霧中的主要的有害物質(zhì)[1]。研究顯示尼古丁通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心血管疾病[2-5]。Apelin-13是apelin受體(apelin receptor, APJ受體)拮抗劑，并且在心臟中高度表達(dá)[6]。Apelin/APJ系統(tǒng)作為心血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵介質(zhì)發(fā)揮作用，并參與心血管疾病的病理生理學(xué)，以apelin/APJ軸為靶點(diǎn)可預(yù)防心血管疾病[7]。最近的證據(jù)表明，apelin/APJ系統(tǒng)通過(guò)不同的信號(hào)途徑，包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,Erk1/2)和caspase信號(hào)通路和自噬途徑，影響心肌的細(xì)胞凋亡[8]。然而 apelin-13對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響以及相應(yīng)的作用機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。我們的研究表明，apelin-13及其類似物可能是開(kāi)發(fā)治療香煙煙霧相關(guān)心血管疾病和損傷的有效藥物。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞系 大鼠H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2試劑及抗體 尼古丁和apelin-13購(gòu)自Sigma；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和0.25%胰酶購(gòu)自Gibco；PI3K/Akt抑制劑LY294002及抗PI3K、p-PI3K、p-Akt、Akt、cleaved caspase-3、caspase-3、GAPDH、APJ、Bax和Bcl-2抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD。

2 主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.2細(xì)胞分組 不同濃度apelin-13對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響時(shí)，分為對(duì)照(control)組、尼古丁(nicotine)組、apelin-13(100 μmol/L)組、apelin-13(200 μmol/L)組、尼古丁+apelin-13(100 μmol/L)組和尼古丁+apelin-13(200 μmol/L)組。檢測(cè)apelin-13通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響，分為對(duì)照組、尼古丁組、LY294002組、apelin-13+尼古丁組和apelin-13+尼古丁+LY294002組。

2.3細(xì)胞給藥處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到60%左右時(shí)給予藥物處理。LY294002(20 μmol/L)和apelin-13(100 μmol/L)采用預(yù)孵育1 h處理，之后尼古丁(10 μmol/L)刺激細(xì)胞48 h處理[9]。

2.4Western blot測(cè)定相關(guān)蛋白含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到60%左右時(shí)給予藥物處理。48 h后收集并裂解細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白含量。取待測(cè)蛋白質(zhì)30 μg加上樣緩沖液煮沸變性，行10%～12% SDS-PAGE，100 V電泳1.5 h，轉(zhuǎn)膜2 h，加入抗Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和GAPDH(1∶1 000)抗體，4 ℃過(guò)夜，常規(guī)洗滌，加相應(yīng)Ⅱ抗(1∶5 000)，37 ℃孵育60 min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶吸光度的比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用ImageJ進(jìn)行灰度值分析，并在Prism上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到60%左右時(shí)給予藥物處理。48 h后收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，使密度為5×108/L，然后用預(yù)冷的PBS沖洗2次，吸去上清液，用100 μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。隨后，將5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和5 μL碘化丙啶PI添加到每個(gè)EP管中。在室溫下避光孵育15 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間差異采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Apelin-13抑制尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡

100 μmol/L和200 μmol/L的apelin-13對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均有明顯的保護(hù)作用，且兩組之間的保護(hù)作用沒(méi)有明顯差異。和正常對(duì)照組相比，尼古丁組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2和APJ的表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與尼古丁組相比，apelin-13+尼古丁組細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.01)，凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào)，Bcl-2和APJ的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

2 Apelin-13的抗凋亡作用可能和PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)

與正常對(duì)照組相比，尼古丁組p-Akt和p-PI3K蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，Akt和PI3K蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化；和尼古丁組相比，apelin-13+尼古丁組p-Akt和p-PI3K蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Effect of apelin-13 on nicotine-induced apoptosis of H9c2 cells. A: the protein expression levels of APJ, Bax, Bcl-2, caspase-3 and cleaved caspase-3 in H9c2 cells; B: the apoptosis was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsnicotine group.

圖1 Apelin-13對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡的影響

Figure 2. Effect of apelin-13 on nicotine-induced PI3K/Akt signaling pathway in H9c2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group.

圖2 Apelin-13對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞信號(hào)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

3 阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路可減弱apelin-13的抗凋亡作用

與正常對(duì)照組相比，PI3K/Akt信號(hào)抑制劑LY294002組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspsae-3的表達(dá)量顯著上調(diào)，而Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化；與apelin-13+尼古丁組相比，apelin-13+尼古丁+LY294002組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspsae-3的表達(dá)顯著上調(diào)，而Bcl-2、p-Akt和p-PI3K蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，Akt和PI3K蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)圖3、4。

討 論

心血管危險(xiǎn)因素在心血管疾病的發(fā)展、進(jìn)展和預(yù)后中起著重要作用，包括高血壓、高脂血癥、吸煙、酗酒、糖尿病、缺乏鍛煉、肥胖和遺傳因素等。全世界每年有1 600多萬(wàn)人死于心血管疾病，糾正這些危險(xiǎn)因素是降低心血管負(fù)擔(dān)的一個(gè)好策略。有充分文獻(xiàn)證明，吸煙是許多心血管疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，心血管疾病是導(dǎo)致吸煙者過(guò)早死亡的主要原因之一[10]。最新報(bào)道表明，與從未吸煙的人相比，吸煙者至少會(huì)失去10年的預(yù)期壽命。然而，很少有預(yù)防或治療措施對(duì)香煙煙霧相關(guān)的心血管毒性作用的報(bào)道。Apelin-13是內(nèi)源性肽，作用于APJ受體，而APJ是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員。Apelin-13和APJ在心臟中高度表達(dá)。最近的證據(jù)強(qiáng)烈表明，apelin/APJ系統(tǒng)通過(guò)不同的信號(hào)途徑，包括PI3K/Akt、Erk1/2和caspase信號(hào)通路和自噬途徑，影響心肌細(xì)胞凋亡[11]。當(dāng)心肌細(xì)胞受到尼古丁或煙霧刺激時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)氧化反應(yīng)的發(fā)生，線粒體的代謝和功能特征改變并且線粒體介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑啟動(dòng)，從而引起線粒體功能障礙和凋亡蛋白的變化，包括Bax和Bcl-2之間的互作用、細(xì)胞色素C和caspase的最終活化，特別是caspase-3，這些凋亡相關(guān)蛋白在細(xì)胞損傷及凋亡的發(fā)生發(fā)展方面起著重要的作用[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠H9c2細(xì)胞體外模擬吸煙引起心肌細(xì)胞凋亡模型。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，尼古丁可以促進(jìn)大鼠H9c2細(xì)胞的凋亡，當(dāng)給予apelin-13不同濃度100 μmol/L和200 μmol/L進(jìn)行預(yù)孵育1 h，再給予尼古丁(10 μmol/L)刺激48 h，結(jié)果顯示，當(dāng)給予apelin-13進(jìn)行預(yù)孵育時(shí)可以抑制尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)也明顯上調(diào)，不同濃度apelin-13(100 μmol/L和200 μmol/L)對(duì)尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯差異，且apelin-13本身并不對(duì)H9c2細(xì)胞本身產(chǎn)生毒性作用，因此在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中采用了100 μmol/L的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。報(bào)道顯示，apelin-13預(yù)處理心肌細(xì)胞可有效抑制葡萄糖剝奪(GD)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并可顯著增加Akt和mTOR的磷酸化，同時(shí)上調(diào)Bcl-2蛋白和下調(diào)Bax和裂解的caspase-3[11]。Apelin/APJ系統(tǒng)也增加Bcl-2的表達(dá)，并降低Bax蛋白的表達(dá)[14]。在apelin-13刺激后，PI3K和Akt激活會(huì)增加。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，當(dāng)給予尼古丁刺激時(shí)，p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，但當(dāng)給予apelin-13預(yù)孵育后，結(jié)果顯示p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。

Figure 3. Role of blocking PI3K/Akt signaling pathway in the protective effect of apelin-13 on H9c2 cells. A: the protein expression levels of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cleaved caspase-3 in H9c2 cells; B: the apoptosis was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group;△P<0.05,△△P<0.01vsnicotine+apelin-13 group.

圖3 阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)apelin-13保護(hù)H9c2細(xì)胞效應(yīng)的影響

Figure 4. Role of blocking PI3K/Akt signaling pathway in the effect of apelin-13 on the expression of PI3K/Akt signaling pathway-related proteins. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsnicotine group;△P<0.05,△△P<0.01vsnicotine+apelin-13 group.

圖4 阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路時(shí)apelin-13對(duì)該通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在相關(guān)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt途徑在細(xì)胞增殖和存活等細(xì)胞功能中起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)PI3K/Akt是抗細(xì)胞凋亡重要的調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)磷酸化或抑制其下游靶蛋白，如caspase-9、BAD、mTOR和NF-κB等，介導(dǎo)各種生長(zhǎng)因子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而來(lái)發(fā)揮其調(diào)控生長(zhǎng)、凋亡和存活等作用[15-16]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證apelin-13的抗凋亡作用是否通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路，本實(shí)驗(yàn)選用了PI3K特異性抑制劑LY294002用于接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，給予LY294002預(yù)孵育1 h后，p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)明顯降低，表明LY294002減弱了apelin-13的抗凋亡作用，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的增加。Akt是一種關(guān)鍵的BAD激酶，可激活BAD中Ser136位點(diǎn)的磷酸化[15]。當(dāng)磷酸化的BAD與14-3-3蛋白結(jié)合時(shí)，它們阻止BAD與Bcl-2或Bcl-xL形成二聚體，因此有效地阻斷由BAD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并抑制促細(xì)胞凋亡活性。由另一種促凋亡蛋白Bax誘導(dǎo)Akt的磷酸化也顯示其促凋亡功能[17]。用特異性PI3K抑制劑渥曼青霉素和LY294002處理后， BAD和Bax同樣能夠抑制Akt的磷酸化[18]。

本實(shí)驗(yàn)闡述了apelin-13對(duì)尼古丁及煙草刺激下導(dǎo)致的心血管疾病起保護(hù)作用的機(jī)理。Apelin-13通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路抑制尼古丁誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。