李清香 吳紅英

(欽州市林業(yè)科學(xué)研究所 廣西欽州535099)

火龍果（Hylocereus undatus），植物學(xué)名是量天尺 ［Hylocereus undatus（Haw.） Britt.et Rose］，是仙人掌科（Seleniereus）量天尺屬［Hylocereus（Berg.） Britt.et Rose］ 多年生攀援肉質(zhì)灌木，又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、玉龍果，原產(chǎn)中美洲至南美洲北部，世界各地廣泛栽培［1］?；瘕埞蚱渫獗砣赓|(zhì)鱗片似蛟龍外鱗而得名，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值，是一種低熱量、高纖維的水果［2-3］，符合現(xiàn)代人對營養(yǎng)、健康的需求，是近年來受消費(fèi)者和種植戶廣泛關(guān)注的一種新興熱帶亞熱帶果樹。廣西‘金都一號’火龍果（桂審果2016007號）是廣西南寧金之都農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司從中南美洲火龍果原種與紅肉種的雜交后代中選育而成。該品種屬于紅皮紅肉，自花授粉，不易裂果，果實(shí)甜度高，在廣西、廣東和海南廣泛種植，是市場熱銷品種之一。由于種植面積逐年擴(kuò)大，對火龍果苗木的需求也不斷增加。采用種子繁殖，繁殖后代易變異，無法保持品種的優(yōu)良特性。采用無性繁殖，可以保持品種的優(yōu)良特性，目前火龍果育苗方式就是以扦插或嫁接為主的無性繁殖。但是傳統(tǒng)的扦插育苗和嫁接育苗，繁殖數(shù)量完全不夠市場的需求，而植物組織培養(yǎng)方式卻可以在短時(shí)間內(nèi)繁育大量品質(zhì)保持一致的苗木，因此研究火龍果組培育苗技術(shù)顯得尤為重要。中國火龍果組培技術(shù)研究起步比較晚，2000年以后才開始有零星報(bào)道［4-15］，火龍果組培技術(shù)開發(fā)的成功試驗(yàn)中，大多數(shù)研究以火龍果莖段為材料，開展外植體消毒、無菌芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)試驗(yàn)，篩選最佳培養(yǎng)方式方法，建立火龍果組培技術(shù)體系。隨著火龍果品質(zhì)的不斷提升，近五年來火龍果開始到得到大眾青睞，商業(yè)栽培的優(yōu)質(zhì)品種，如‘金都一號’、‘桂紅龍’、‘大紅’等，經(jīng)濟(jì)效益高、品質(zhì)穩(wěn)定，種植面積逐年增加。由于‘金都一號’是新選育出來的且已通過區(qū)域?qū)彾ǖ钠贩N，市場需求量大，通過組培快繁技術(shù)可以有效提供品質(zhì)一致的苗木。通過查閱文獻(xiàn)可知，近年來有關(guān)‘金都一號’組培技術(shù)的研究報(bào)道很少，僅有洪青梅等［16］有針對性地對該品種進(jìn)行外植體誘導(dǎo)的研究，而未有其系統(tǒng)的研究成果，無法建立‘金都一號’組培技術(shù)體系。因此，很有必要在前人的研究基礎(chǔ)上開展‘金都一號’組培技術(shù)的研究，初步建立一套‘金都一號’組培技術(shù)體系，為后續(xù)的研究提供重要參考資料，從而為新品種的推廣提供優(yōu)質(zhì)苗木。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣西欽州市林業(yè)科學(xué)研究所于2016年引種‘金都一號’，為了保證母株的安全，杜絕外界病毒的感染，引進(jìn)的‘金都一號’種植于大棚內(nèi)。本研究的所需材料均出自其新萌芽的莖段，將新萌芽的莖段剪下來帶回實(shí)驗(yàn)室，先用清水沖洗，同時(shí)用毛刷輕輕刷洗刺座位置，將外植體表面的泥沙沖洗干凈，然后瀝干水份，裝入干凈的杯子備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒試驗(yàn)

本試驗(yàn)選擇75%酒精和0.1%升汞2種常規(guī)的消毒劑，采用2種消毒方式（0.1%升汞、75%酒精＋0.1%升汞），其中升汞消毒時(shí)間分別為5、10、15min，75%酒精消毒時(shí)間為20 s。

將處理好的外植體放到超凈工作臺上，按設(shè)計(jì)方案依次操作，最后用無菌水清洗3～4次，每次沖洗1～2 min，瀝干表面水分；切掉外植體切口壞死的部分肉莖，然后把外植體切割成每段帶有2～3個(gè)刺座的莖段，垂直插入預(yù)培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種20瓶，重復(fù)3次，每瓶接種1個(gè)莖段；接種后7 d檢查污染情況，統(tǒng)計(jì)污染數(shù)。

1.2.2 無菌芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑 6-BA （1、5、8、11） mg/L、NAA （1、0.1） mg/L，對外植體進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn)，觀察不同配方對外植體誘導(dǎo)無菌芽的效果。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后未污染、外植體顏色未變、切口愈傷組織正常的莖段進(jìn)行切割，切割時(shí)以莖段棱柱的中心點(diǎn)為切割點(diǎn)，把棱柱縱向切割成3個(gè)棱邊，然后再橫向切割成帶1個(gè)刺座的組織塊，轉(zhuǎn)入無菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，注意刺座不要插入培養(yǎng)基中，以免影響萌芽；每個(gè)處理接種30瓶，重復(fù)3次，每瓶接種1個(gè)組織塊；接種后40 d觀察無菌芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)無菌芽誘導(dǎo)成功數(shù)。

1.2.3 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不同倍量大量元素（1/2、1、3/2）、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA（0.5、1、2） mg/L、NAA （0、0.1、0.2） mg/L組合的配方，設(shè)計(jì)3個(gè)因素各3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，選擇L9（34）正交表，共計(jì)9個(gè)處理，對無菌芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)試驗(yàn)，每個(gè)配方配制30瓶培養(yǎng)基；將無菌芽接種到增殖培養(yǎng)基，共9個(gè)處理，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每瓶培養(yǎng)基接種一個(gè)完整芽；接種45 d后將新萌發(fā)的芽條切割成長度一致的莖段，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方不變）培養(yǎng)，培養(yǎng)周期均為45 d，連續(xù)培養(yǎng)3代（周期），抽檢記錄增殖數(shù)量及生長情況，統(tǒng)計(jì)繼代增殖系數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以不同倍量大量元素（1/2、1）、不同濃度的生根劑 ABT6（0、0.5、1）mg/L、 IBA （0、 0.5、 1） mg/L、 NAA （0、 0.1、0.2）mg/L組合的配方，設(shè)計(jì)2水平1因素和3水平3因素的正交試驗(yàn)，選擇L18（2×37）正交表，對火龍果不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn)，共計(jì)18個(gè)處理。

將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽的頂芽進(jìn)行切割，每段長度約2 cm，垂直插入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基，共18個(gè)處理，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每瓶接種6個(gè)頂芽；接種后30 d統(tǒng)計(jì)每瓶生根株數(shù)、每株生根數(shù)、平均根長及株高。

1.2.5 培養(yǎng)條件

預(yù)培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)基、無菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂（強(qiáng)度為1 200）3.0 g/L，除增殖培養(yǎng)基需要指定pH值外，其余配方pH均為5.8；生根培養(yǎng)基加入蔗糖15 g/L、瓊脂3.2 g/L、pH 6.0。按常規(guī)要求將各個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行配制、高壓滅菌、靜置冷卻備用。培養(yǎng)室溫度26～28℃，每天光照13～14 h，光照強(qiáng)度2 000～5 000 lx。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2007和SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式及消毒時(shí)間對外植體消毒效果的影響

采用不同消毒方式與消毒時(shí)間對火龍果外植體進(jìn)行消毒試驗(yàn)，其結(jié)果見表1。消毒效果最好的是處理5，污染率為55.70%；其次是處理6，污染率為57.23%；最差的是處理1，污染率為91.83%。

通過對以上結(jié)果進(jìn)行單變量雙因素方差分析（表2）可知，雙因素均達(dá)到顯著差異，即不同消毒方式與消毒時(shí)間對外植體污染影響達(dá)到顯著水平。2種消毒方式的消毒效果達(dá)到顯著差異，最好的消毒方式是復(fù)合消毒（即75%酒精＋0.1%升汞）。3個(gè)水平消毒時(shí)間的消毒效果也達(dá)到顯著差異，其中消毒時(shí)間為5 min的消毒效果與10和15 min消毒效果達(dá)到顯著性差異，而消毒時(shí)間為10和15 min的消毒效果沒有顯著性差異，因此合適的消毒時(shí)間為10和15 min。

表1 廣西‘金都一號’火龍果外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果

表2 不同消毒組合及消毒時(shí)間對外植體污染率的影響結(jié)果

綜上，火龍果外植體消毒最佳方式為處理5和處理6，即先用75%酒精消毒20 s后，再用0.1%升汞消毒10～15 min。

2.2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)無菌芽效果

以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加4個(gè)濃度6-BA與2個(gè)濃度NAA，共計(jì)8種培養(yǎng)基（即8種處理），試驗(yàn)結(jié)果見表3。誘導(dǎo)率最高的是6號培養(yǎng)基，為85.56%；其次是5號培養(yǎng)基，為83.33%；最差的是1號和3號培養(yǎng)基，僅為2.22%和3.33%。

通過對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行單因變量雙因素方差分析（表4）可知，不同濃度的6-BA對無菌芽誘導(dǎo)結(jié)果影響達(dá)到顯著性差異，6-BA對誘導(dǎo)率影響很大，其中6-BA濃度為8.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好，濃度為1.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差。不同濃度的NAA對無菌芽誘導(dǎo)結(jié)果的影響未達(dá)到顯著性差異，即NAA對誘導(dǎo)率影響不大。

綜上，火龍果外植體誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基為：MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L（即6號培養(yǎng)基），誘導(dǎo)的無菌芽如圖1所示。

表3 廣西‘金都一號’火龍果無菌芽誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

2.3 不同培養(yǎng)基增殖效果

不同培養(yǎng)基增殖效果如表5所示。經(jīng)分析可知：平均增殖系數(shù)最高的是6號培養(yǎng)基，為7.13；其次是處理9，為6.67；最差的是1號培養(yǎng)基，僅4.07。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析可知，對增殖系數(shù)影響的主次關(guān)系為A＞B＞C，初步篩選最優(yōu)組合為A2B3C1（即6號培養(yǎng)基）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證各因素間的顯著性，對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單變量多因素方差分析，結(jié)果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果增殖系數(shù)的影響均達(dá)到顯著性差異。通過Duncan法對各因素各水平進(jìn)行多重比較（表6）可知，A因素中水平2與水平3差異不顯著，但與水平1差異顯著，其增殖系數(shù)從高到低依次為A3＞A2＞A1；B因素中3個(gè)水平的增殖系數(shù)均達(dá)到顯著差異水平，其增殖系數(shù)從高到低依次為B3＞B2＞B1；C因素中水平水平2和水平3差異不顯著，但與水平1差異達(dá)到顯著性，其增殖系數(shù)從高到低依次為C1＞C3＞C2。通過方差分析篩選出最佳組合為A2B3C1，該組合正是正交試驗(yàn)中增殖系數(shù)最高的6號培養(yǎng)基。

表4 不同6-BA及NAA濃度對火龍果無菌芽誘導(dǎo)的影響

圖1 6號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的無菌芽

表5 廣西‘金都一號’火龍果繼代增殖試驗(yàn)結(jié)果

表6 不同大量元素、6-BA及NAA濃度對火龍果繼代增殖的影響結(jié)果

綜上，火龍果增殖培養(yǎng)基配方最佳組合為：MS＋6-BA 2.0 mg/L（即6號培養(yǎng)基），增殖培養(yǎng)1～3代苗木生長情況如圖2所示。

2.4 不同培養(yǎng)基生根效果

生根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果見表7所示。5號培養(yǎng)基生根率最高，為93.33%；其次是14號培養(yǎng)基，為89.44%；最差的是1、4、13號培養(yǎng)基，生根率不到10%。為了檢驗(yàn)各因素之間的顯著性，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量多因素方差分析，其結(jié)果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果生根率的影響均達(dá)到顯著性差異。通過利用Duncan法對各因素各水平進(jìn)行多重比較（表8）可知，各因素各水平對火龍果生根率的影響均達(dá)到顯著性差異，最佳組合為A2B2C2D2。由于篩選的最佳組合不在正交試驗(yàn)中，所以補(bǔ)做此組合的驗(yàn)證試驗(yàn)，測得生根率為98.56%，高于正交試驗(yàn)中生根率最高組合A1B2C2D2（即5號培養(yǎng)基），苗壯根粗，分枝少。

圖2 6號培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)（從左至右，依次是第1代、第2代、第3代）

表7 廣西‘金都一號’火龍果生根試驗(yàn)結(jié)果

表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA濃度對火龍果生根率的影響結(jié)果

綜上，火龍果生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方是：MS＋ABT60.5 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根苗木長勢如圖3所示。

圖3 廣西‘金都一號’生根培養(yǎng)（左圖是5號培養(yǎng)基苗木長勢，右圖是調(diào)整后最佳配方）

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體污染問題

外植體消毒一般使用組合消毒方式，其中最常用組合是 75%酒精與 0.1%升汞［4-6，13，16］，酒精能夠滲透到菌體內(nèi)，使組成菌體的蛋白質(zhì)凝固，從而殺死外植體表面的菌類。值得注意的是酒精濃度以75%消毒效果最佳，過低或過高濃度的酒精殺菌效果會(huì)降低很多。升汞是一種殺菌力很強(qiáng)的殺菌劑，主要靠汞離子進(jìn)入菌類細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞失活或變性，從而達(dá)到消毒作用。微量的升汞還能在細(xì)胞內(nèi)不斷累積并最終對生物體產(chǎn)生毒害作用。因此，使用75%酒精與0.1%升汞組合消毒外植體時(shí)，消毒時(shí)間一定要掌握恰當(dāng)，因?yàn)橄緞┰跉⑺谰惖耐瑫r(shí)也會(huì)殺死外植體，尤其是外植體切口處、幼嫩部位受毒害最嚴(yán)重［13］。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10～15 min的組合方式對火龍果外植體進(jìn)行表面消毒，污染率為55.70%，這個(gè)組合方式的消毒效果最好。

火龍果莖段外植體表面光滑，芽眼的刺座處一般污染比較嚴(yán)重，這是因?yàn)檠垦厶庨L有成叢的葉刺，容易窩藏較多的雜菌，雖然用毛刷刷洗，但也難以清洗干凈，消毒劑也較難滲入，因此容易因消毒不徹底而造成污染［6，14］。雖然本研究對火龍果外植體進(jìn)行（如移植大棚內(nèi)培養(yǎng)、毛刷刷洗刺座處、洗潔精浸泡等）預(yù)處理，但是絕大部分污染還是出現(xiàn)在刺座處，因此對火龍果外植體消毒方法還需作進(jìn)一步研究。

3.2 繼代培養(yǎng)

火龍果初代培養(yǎng)，也叫啟動(dòng)培養(yǎng)，需要較高濃度的細(xì)胞分裂素刺激才能分化出無菌芽，當(dāng)然不是越高越好，本研究中當(dāng)6-BA濃度達(dá)到8 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率最高，達(dá)到85.47%，低于或高于該濃度，誘導(dǎo)率達(dá)不到50%。相對于初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)卻不能使用高濃度細(xì)胞分裂素，因?yàn)槿菀壮霈F(xiàn)畸形芽，本研究繼代增殖培養(yǎng)基中6-BA使用濃度為2.0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)達(dá)到最高。除了激素外，影響繼代培養(yǎng)的還有大量元素、微量元素及有機(jī)物，本研究就大量元素半量、全量和倍量3種不同濃度進(jìn)行對比試驗(yàn)，其中全量和倍量表現(xiàn)突出，綜合考慮以全量為最佳選擇。因此最終篩選出火龍果繼代適宜培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L，增殖系數(shù)為7.13。本研究結(jié)果與很多報(bào)道的結(jié)果不同［6-7，10］，如與周傳明等［6］研究結(jié)果剛好相反，其誘導(dǎo)腋芽最佳培養(yǎng)基是MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最佳增殖和繼代培養(yǎng)基均是MS＋12.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L，這可能是不同品種適合不同的培養(yǎng)配方。

3.3 生根培養(yǎng)

火龍果為多年生肉質(zhì)植物，生長旺盛，萌芽力和發(fā)枝力較強(qiáng)，易生氣生根，此生物特性有利于其組培生根培養(yǎng)［15］，因此火龍果屬于比較容易誘導(dǎo)根系的樹種，但是也容易誘導(dǎo)出過多氣生根、分枝，影響生根苗質(zhì)量?；瘕埞T導(dǎo)培養(yǎng)基中一般大量元素為半量，即 1/2［4，11，13-14］，主要是因?yàn)闋I養(yǎng)元素減少可抑制側(cè)芽萌發(fā)，從而促進(jìn)根系生長，達(dá)到誘導(dǎo)出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培養(yǎng)基生根率達(dá)到93.33%，苗壯根粗，分枝少，效果也不錯(cuò)，但是通過分析及驗(yàn)證，最終篩選的最佳配方是MS＋ABT60.5 mg/L＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根率達(dá)到98.56%，苗壯根粗，分枝少。因此不同品種對培養(yǎng)基配方要求不同，需要科技人員通過科學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行篩選。