李清香 吳紅英

(欽州市林業(yè)科學研究所 廣西欽州535099)

火龍果（Hylocereus undatus），植物學名是量天尺 ［Hylocereus undatus（Haw.） Britt.et Rose］，是仙人掌科（Seleniereus）量天尺屬［Hylocereus（Berg.） Britt.et Rose］ 多年生攀援肉質(zhì)灌木，又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、玉龍果，原產(chǎn)中美洲至南美洲北部，世界各地廣泛栽培［1］?；瘕埞蚱渫獗砣赓|(zhì)鱗片似蛟龍外鱗而得名，具有豐富的營養(yǎng)價值，是一種低熱量、高纖維的水果［2-3］，符合現(xiàn)代人對營養(yǎng)、健康的需求，是近年來受消費者和種植戶廣泛關注的一種新興熱帶亞熱帶果樹。廣西‘金都一號’火龍果（桂審果2016007號）是廣西南寧金之都農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司從中南美洲火龍果原種與紅肉種的雜交后代中選育而成。該品種屬于紅皮紅肉，自花授粉，不易裂果，果實甜度高，在廣西、廣東和海南廣泛種植，是市場熱銷品種之一。由于種植面積逐年擴大，對火龍果苗木的需求也不斷增加。采用種子繁殖，繁殖后代易變異，無法保持品種的優(yōu)良特性。采用無性繁殖，可以保持品種的優(yōu)良特性，目前火龍果育苗方式就是以扦插或嫁接為主的無性繁殖。但是傳統(tǒng)的扦插育苗和嫁接育苗，繁殖數(shù)量完全不夠市場的需求，而植物組織培養(yǎng)方式卻可以在短時間內(nèi)繁育大量品質(zhì)保持一致的苗木，因此研究火龍果組培育苗技術顯得尤為重要。中國火龍果組培技術研究起步比較晚，2000年以后才開始有零星報道［4-15］，火龍果組培技術開發(fā)的成功試驗中，大多數(shù)研究以火龍果莖段為材料，開展外植體消毒、無菌芽誘導、繼代增殖和生根誘導試驗，篩選最佳培養(yǎng)方式方法，建立火龍果組培技術體系。隨著火龍果品質(zhì)的不斷提升，近五年來火龍果開始到得到大眾青睞，商業(yè)栽培的優(yōu)質(zhì)品種，如‘金都一號’、‘桂紅龍’、‘大紅’等，經(jīng)濟效益高、品質(zhì)穩(wěn)定，種植面積逐年增加。由于‘金都一號’是新選育出來的且已通過區(qū)域?qū)彾ǖ钠贩N，市場需求量大，通過組培快繁技術可以有效提供品質(zhì)一致的苗木。通過查閱文獻可知，近年來有關‘金都一號’組培技術的研究報道很少，僅有洪青梅等［16］有針對性地對該品種進行外植體誘導的研究，而未有其系統(tǒng)的研究成果，無法建立‘金都一號’組培技術體系。因此，很有必要在前人的研究基礎上開展‘金都一號’組培技術的研究，初步建立一套‘金都一號’組培技術體系，為后續(xù)的研究提供重要參考資料，從而為新品種的推廣提供優(yōu)質(zhì)苗木。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廣西欽州市林業(yè)科學研究所于2016年引種‘金都一號’，為了保證母株的安全，杜絕外界病毒的感染，引進的‘金都一號’種植于大棚內(nèi)。本研究的所需材料均出自其新萌芽的莖段，將新萌芽的莖段剪下來帶回實驗室，先用清水沖洗，同時用毛刷輕輕刷洗刺座位置，將外植體表面的泥沙沖洗干凈，然后瀝干水份，裝入干凈的杯子備用。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒試驗

本試驗選擇75%酒精和0.1%升汞2種常規(guī)的消毒劑，采用2種消毒方式（0.1%升汞、75%酒精＋0.1%升汞），其中升汞消毒時間分別為5、10、15min，75%酒精消毒時間為20 s。

將處理好的外植體放到超凈工作臺上，按設計方案依次操作，最后用無菌水清洗3～4次，每次沖洗1～2 min，瀝干表面水分；切掉外植體切口壞死的部分肉莖，然后把外植體切割成每段帶有2～3個刺座的莖段，垂直插入預培養(yǎng)基中，每個處理接種20瓶，重復3次，每瓶接種1個莖段；接種后7 d檢查污染情況，統(tǒng)計污染數(shù)。

1.2.2 無菌芽誘導試驗

以MS為基礎培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑 6-BA （1、5、8、11） mg/L、NAA （1、0.1） mg/L，對外植體進行誘導試驗，觀察不同配方對外植體誘導無菌芽的效果。將經(jīng)過預培養(yǎng)后未污染、外植體顏色未變、切口愈傷組織正常的莖段進行切割，切割時以莖段棱柱的中心點為切割點，把棱柱縱向切割成3個棱邊，然后再橫向切割成帶1個刺座的組織塊，轉(zhuǎn)入無菌芽誘導培養(yǎng)基，注意刺座不要插入培養(yǎng)基中，以免影響萌芽；每個處理接種30瓶，重復3次，每瓶接種1個組織塊；接種后40 d觀察無菌芽萌發(fā)情況，統(tǒng)計無菌芽誘導成功數(shù)。

1.2.3 增殖培養(yǎng)試驗

以MS為基礎培養(yǎng)基，以不同倍量大量元素（1/2、1、3/2）、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA（0.5、1、2） mg/L、NAA （0、0.1、0.2） mg/L組合的配方，設計3個因素各3個水平的正交試驗，選擇L9（34）正交表，共計9個處理，對無菌芽進行增殖培養(yǎng)試驗，每個配方配制30瓶培養(yǎng)基；將無菌芽接種到增殖培養(yǎng)基，共9個處理，每個處理接種10瓶，重復3次，每瓶培養(yǎng)基接種一個完整芽；接種45 d后將新萌發(fā)的芽條切割成長度一致的莖段，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配方不變）培養(yǎng)，培養(yǎng)周期均為45 d，連續(xù)培養(yǎng)3代（周期），抽檢記錄增殖數(shù)量及生長情況，統(tǒng)計繼代增殖系數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)試驗

以MS為基礎培養(yǎng)基，以不同倍量大量元素（1/2、1）、不同濃度的生根劑 ABT6（0、0.5、1）mg/L、 IBA （0、 0.5、 1） mg/L、 NAA （0、 0.1、0.2）mg/L組合的配方，設計2水平1因素和3水平3因素的正交試驗，選擇L18（2×37）正交表，對火龍果不定芽進行生根誘導試驗，共計18個處理。

將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽的頂芽進行切割，每段長度約2 cm，垂直插入生根誘導培養(yǎng)基，共18個處理，每個處理接種10瓶，重復3次，每瓶接種6個頂芽；接種后30 d統(tǒng)計每瓶生根株數(shù)、每株生根數(shù)、平均根長及株高。

1.2.5 培養(yǎng)條件

預培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基，預培養(yǎng)基、無菌芽誘導培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂（強度為1 200）3.0 g/L，除增殖培養(yǎng)基需要指定pH值外，其余配方pH均為5.8；生根培養(yǎng)基加入蔗糖15 g/L、瓊脂3.2 g/L、pH 6.0。按常規(guī)要求將各個培養(yǎng)基進行配制、高壓滅菌、靜置冷卻備用。培養(yǎng)室溫度26～28℃，每天光照13～14 h，光照強度2 000～5 000 lx。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

使用Excel2007和SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒方式及消毒時間對外植體消毒效果的影響

采用不同消毒方式與消毒時間對火龍果外植體進行消毒試驗，其結果見表1。消毒效果最好的是處理5，污染率為55.70%；其次是處理6，污染率為57.23%；最差的是處理1，污染率為91.83%。

通過對以上結果進行單變量雙因素方差分析（表2）可知，雙因素均達到顯著差異，即不同消毒方式與消毒時間對外植體污染影響達到顯著水平。2種消毒方式的消毒效果達到顯著差異，最好的消毒方式是復合消毒（即75%酒精＋0.1%升汞）。3個水平消毒時間的消毒效果也達到顯著差異，其中消毒時間為5 min的消毒效果與10和15 min消毒效果達到顯著性差異，而消毒時間為10和15 min的消毒效果沒有顯著性差異，因此合適的消毒時間為10和15 min。

表1 廣西‘金都一號’火龍果外植體消毒試驗結果

表2 不同消毒組合及消毒時間對外植體污染率的影響結果

綜上，火龍果外植體消毒最佳方式為處理5和處理6，即先用75%酒精消毒20 s后，再用0.1%升汞消毒10～15 min。

2.2 不同培養(yǎng)基誘導無菌芽效果

以MS為基礎培養(yǎng)基，附加4個濃度6-BA與2個濃度NAA，共計8種培養(yǎng)基（即8種處理），試驗結果見表3。誘導率最高的是6號培養(yǎng)基，為85.56%；其次是5號培養(yǎng)基，為83.33%；最差的是1號和3號培養(yǎng)基，僅為2.22%和3.33%。

通過對以上數(shù)據(jù)進行單因變量雙因素方差分析（表4）可知，不同濃度的6-BA對無菌芽誘導結果影響達到顯著性差異，6-BA對誘導率影響很大，其中6-BA濃度為8.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導效果最好，濃度為1.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導效果最差。不同濃度的NAA對無菌芽誘導結果的影響未達到顯著性差異，即NAA對誘導率影響不大。

綜上，火龍果外植體誘導最適合的培養(yǎng)基為：MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L（即6號培養(yǎng)基），誘導的無菌芽如圖1所示。

表3 廣西‘金都一號’火龍果無菌芽誘導試驗結果

2.3 不同培養(yǎng)基增殖效果

不同培養(yǎng)基增殖效果如表5所示。經(jīng)分析可知：平均增殖系數(shù)最高的是6號培養(yǎng)基，為7.13；其次是處理9，為6.67；最差的是1號培養(yǎng)基，僅4.07。對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析可知，對增殖系數(shù)影響的主次關系為A＞B＞C，初步篩選最優(yōu)組合為A2B3C1（即6號培養(yǎng)基）。為了進一步驗證各因素間的顯著性，對正交試驗結果進行單變量多因素方差分析，結果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果增殖系數(shù)的影響均達到顯著性差異。通過Duncan法對各因素各水平進行多重比較（表6）可知，A因素中水平2與水平3差異不顯著，但與水平1差異顯著，其增殖系數(shù)從高到低依次為A3＞A2＞A1；B因素中3個水平的增殖系數(shù)均達到顯著差異水平，其增殖系數(shù)從高到低依次為B3＞B2＞B1；C因素中水平水平2和水平3差異不顯著，但與水平1差異達到顯著性，其增殖系數(shù)從高到低依次為C1＞C3＞C2。通過方差分析篩選出最佳組合為A2B3C1，該組合正是正交試驗中增殖系數(shù)最高的6號培養(yǎng)基。

表4 不同6-BA及NAA濃度對火龍果無菌芽誘導的影響

圖1 6號培養(yǎng)基誘導的無菌芽

表5 廣西‘金都一號’火龍果繼代增殖試驗結果

表6 不同大量元素、6-BA及NAA濃度對火龍果繼代增殖的影響結果

綜上，火龍果增殖培養(yǎng)基配方最佳組合為：MS＋6-BA 2.0 mg/L（即6號培養(yǎng)基），增殖培養(yǎng)1～3代苗木生長情況如圖2所示。

2.4 不同培養(yǎng)基生根效果

生根誘導試驗結果見表7所示。5號培養(yǎng)基生根率最高，為93.33%；其次是14號培養(yǎng)基，為89.44%；最差的是1、4、13號培養(yǎng)基，生根率不到10%。為了檢驗各因素之間的顯著性，對試驗數(shù)據(jù)進行單變量多因素方差分析，其結果顯示各因素F值均小于p（0.05），因此各因素對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異。通過利用Duncan法對各因素各水平進行多重比較（表8）可知，各因素各水平對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異，最佳組合為A2B2C2D2。由于篩選的最佳組合不在正交試驗中，所以補做此組合的驗證試驗，測得生根率為98.56%，高于正交試驗中生根率最高組合A1B2C2D2（即5號培養(yǎng)基），苗壯根粗，分枝少。

圖2 6號培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)（從左至右，依次是第1代、第2代、第3代）

表7 廣西‘金都一號’火龍果生根試驗結果

表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA濃度對火龍果生根率的影響結果

綜上，火龍果生根誘導最佳培養(yǎng)基配方是：MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根苗木長勢如圖3所示。

圖3 廣西‘金都一號’生根培養(yǎng)（左圖是5號培養(yǎng)基苗木長勢，右圖是調(diào)整后最佳配方）

3 討論與結論

3.1 外植體污染問題

外植體消毒一般使用組合消毒方式，其中最常用組合是 75%酒精與 0.1%升汞［4-6，13，16］，酒精能夠滲透到菌體內(nèi)，使組成菌體的蛋白質(zhì)凝固，從而殺死外植體表面的菌類。值得注意的是酒精濃度以75%消毒效果最佳，過低或過高濃度的酒精殺菌效果會降低很多。升汞是一種殺菌力很強的殺菌劑，主要靠汞離子進入菌類細胞內(nèi)，使細胞失活或變性，從而達到消毒作用。微量的升汞還能在細胞內(nèi)不斷累積并最終對生物體產(chǎn)生毒害作用。因此，使用75%酒精與0.1%升汞組合消毒外植體時，消毒時間一定要掌握恰當，因為消毒劑在殺死菌類的同時也會殺死外植體，尤其是外植體切口處、幼嫩部位受毒害最嚴重［13］。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10～15 min的組合方式對火龍果外植體進行表面消毒，污染率為55.70%，這個組合方式的消毒效果最好。

火龍果莖段外植體表面光滑，芽眼的刺座處一般污染比較嚴重，這是因為芽眼處長有成叢的葉刺，容易窩藏較多的雜菌，雖然用毛刷刷洗，但也難以清洗干凈，消毒劑也較難滲入，因此容易因消毒不徹底而造成污染［6，14］。雖然本研究對火龍果外植體進行（如移植大棚內(nèi)培養(yǎng)、毛刷刷洗刺座處、洗潔精浸泡等）預處理，但是絕大部分污染還是出現(xiàn)在刺座處，因此對火龍果外植體消毒方法還需作進一步研究。

3.2 繼代培養(yǎng)

火龍果初代培養(yǎng)，也叫啟動培養(yǎng)，需要較高濃度的細胞分裂素刺激才能分化出無菌芽，當然不是越高越好，本研究中當6-BA濃度達到8 mg/L時，誘導率最高，達到85.47%，低于或高于該濃度，誘導率達不到50%。相對于初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)卻不能使用高濃度細胞分裂素，因為容易出現(xiàn)畸形芽，本研究繼代增殖培養(yǎng)基中6-BA使用濃度為2.0 mg/L時，增殖系數(shù)達到最高。除了激素外，影響繼代培養(yǎng)的還有大量元素、微量元素及有機物，本研究就大量元素半量、全量和倍量3種不同濃度進行對比試驗，其中全量和倍量表現(xiàn)突出，綜合考慮以全量為最佳選擇。因此最終篩選出火龍果繼代適宜培養(yǎng)基為MS＋6-BA 2.0 mg/L，增殖系數(shù)為7.13。本研究結果與很多報道的結果不同［6-7，10］，如與周傳明等［6］研究結果剛好相反，其誘導腋芽最佳培養(yǎng)基是MS＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L，最佳增殖和繼代培養(yǎng)基均是MS＋12.0mg/L＋NAA 0.1 mg/L，這可能是不同品種適合不同的培養(yǎng)配方。

3.3 生根培養(yǎng)

火龍果為多年生肉質(zhì)植物，生長旺盛，萌芽力和發(fā)枝力較強，易生氣生根，此生物特性有利于其組培生根培養(yǎng)［15］，因此火龍果屬于比較容易誘導根系的樹種，但是也容易誘導出過多氣生根、分枝，影響生根苗質(zhì)量。火龍果生根誘導培養(yǎng)基中一般大量元素為半量，即 1/2［4，11，13-14］，主要是因為營養(yǎng)元素減少可抑制側芽萌發(fā)，從而促進根系生長，達到誘導出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培養(yǎng)基生根率達到93.33%，苗壯根粗，分枝少，效果也不錯，但是通過分析及驗證，最終篩選的最佳配方是MS＋ABT60.5 mg/L＋IBA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，生根率達到98.56%，苗壯根粗，分枝少。因此不同品種對培養(yǎng)基配方要求不同，需要科技人員通過科學試驗進行篩選。