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        廣西‘金都一號’火龍果組培技術(shù)①

        2019-08-23 09:38:46李清香吳紅英
        熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年6期
        關(guān)鍵詞:升汞外植體火龍果

        李清香 吳紅英

        (欽州市林業(yè)科學(xué)研究所 廣西欽州535099)

        火龍果(Hylocereus undatus),植物學(xué)名是量天尺 [Hylocereus undatus(Haw.) Britt.et Rose],是仙人掌科(Seleniereus)量天尺屬[Hylocereus(Berg.) Britt.et Rose] 多年生攀援肉質(zhì)灌木,又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、玉龍果,原產(chǎn)中美洲至南美洲北部,世界各地廣泛栽培[1]?;瘕埞蚱渫獗砣赓|(zhì)鱗片似蛟龍外鱗而得名,具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值,是一種低熱量、高纖維的水果[2-3],符合現(xiàn)代人對營養(yǎng)、健康的需求,是近年來受消費(fèi)者和種植戶廣泛關(guān)注的一種新興熱帶亞熱帶果樹。廣西‘金都一號’火龍果(桂審果2016007號)是廣西南寧金之都農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司從中南美洲火龍果原種與紅肉種的雜交后代中選育而成。該品種屬于紅皮紅肉,自花授粉,不易裂果,果實(shí)甜度高,在廣西、廣東和海南廣泛種植,是市場熱銷品種之一。由于種植面積逐年擴(kuò)大,對火龍果苗木的需求也不斷增加。采用種子繁殖,繁殖后代易變異,無法保持品種的優(yōu)良特性。采用無性繁殖,可以保持品種的優(yōu)良特性,目前火龍果育苗方式就是以扦插或嫁接為主的無性繁殖。但是傳統(tǒng)的扦插育苗和嫁接育苗,繁殖數(shù)量完全不夠市場的需求,而植物組織培養(yǎng)方式卻可以在短時(shí)間內(nèi)繁育大量品質(zhì)保持一致的苗木,因此研究火龍果組培育苗技術(shù)顯得尤為重要。中國火龍果組培技術(shù)研究起步比較晚,2000年以后才開始有零星報(bào)道[4-15],火龍果組培技術(shù)開發(fā)的成功試驗(yàn)中,大多數(shù)研究以火龍果莖段為材料,開展外植體消毒、無菌芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)試驗(yàn),篩選最佳培養(yǎng)方式方法,建立火龍果組培技術(shù)體系。隨著火龍果品質(zhì)的不斷提升,近五年來火龍果開始到得到大眾青睞,商業(yè)栽培的優(yōu)質(zhì)品種,如‘金都一號’、‘桂紅龍’、‘大紅’等,經(jīng)濟(jì)效益高、品質(zhì)穩(wěn)定,種植面積逐年增加。由于‘金都一號’是新選育出來的且已通過區(qū)域?qū)彾ǖ钠贩N,市場需求量大,通過組培快繁技術(shù)可以有效提供品質(zhì)一致的苗木。通過查閱文獻(xiàn)可知,近年來有關(guān)‘金都一號’組培技術(shù)的研究報(bào)道很少,僅有洪青梅等[16]有針對性地對該品種進(jìn)行外植體誘導(dǎo)的研究,而未有其系統(tǒng)的研究成果,無法建立‘金都一號’組培技術(shù)體系。因此,很有必要在前人的研究基礎(chǔ)上開展‘金都一號’組培技術(shù)的研究,初步建立一套‘金都一號’組培技術(shù)體系,為后續(xù)的研究提供重要參考資料,從而為新品種的推廣提供優(yōu)質(zhì)苗木。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        廣西欽州市林業(yè)科學(xué)研究所于2016年引種‘金都一號’,為了保證母株的安全,杜絕外界病毒的感染,引進(jìn)的‘金都一號’種植于大棚內(nèi)。本研究的所需材料均出自其新萌芽的莖段,將新萌芽的莖段剪下來帶回實(shí)驗(yàn)室,先用清水沖洗,同時(shí)用毛刷輕輕刷洗刺座位置,將外植體表面的泥沙沖洗干凈,然后瀝干水份,裝入干凈的杯子備用。

        1.2 方法

        1.2.1 外植體消毒試驗(yàn)

        本試驗(yàn)選擇75%酒精和0.1%升汞2種常規(guī)的消毒劑,采用2種消毒方式(0.1%升汞、75%酒精+0.1%升汞),其中升汞消毒時(shí)間分別為5、10、15min,75%酒精消毒時(shí)間為20 s。

        將處理好的外植體放到超凈工作臺上,按設(shè)計(jì)方案依次操作,最后用無菌水清洗3~4次,每次沖洗1~2 min,瀝干表面水分;切掉外植體切口壞死的部分肉莖,然后把外植體切割成每段帶有2~3個(gè)刺座的莖段,垂直插入預(yù)培養(yǎng)基中,每個(gè)處理接種20瓶,重復(fù)3次,每瓶接種1個(gè)莖段;接種后7 d檢查污染情況,統(tǒng)計(jì)污染數(shù)。

        1.2.2 無菌芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

        以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑 6-BA (1、5、8、11) mg/L、NAA (1、0.1) mg/L,對外植體進(jìn)行誘導(dǎo)試驗(yàn),觀察不同配方對外植體誘導(dǎo)無菌芽的效果。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)后未污染、外植體顏色未變、切口愈傷組織正常的莖段進(jìn)行切割,切割時(shí)以莖段棱柱的中心點(diǎn)為切割點(diǎn),把棱柱縱向切割成3個(gè)棱邊,然后再橫向切割成帶1個(gè)刺座的組織塊,轉(zhuǎn)入無菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,注意刺座不要插入培養(yǎng)基中,以免影響萌芽;每個(gè)處理接種30瓶,重復(fù)3次,每瓶接種1個(gè)組織塊;接種后40 d觀察無菌芽萌發(fā)情況,統(tǒng)計(jì)無菌芽誘導(dǎo)成功數(shù)。

        1.2.3 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

        以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以不同倍量大量元素(1/2、1、3/2)、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA(0.5、1、2) mg/L、NAA (0、0.1、0.2) mg/L組合的配方,設(shè)計(jì)3個(gè)因素各3個(gè)水平的正交試驗(yàn),選擇L9(34)正交表,共計(jì)9個(gè)處理,對無菌芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)試驗(yàn),每個(gè)配方配制30瓶培養(yǎng)基;將無菌芽接種到增殖培養(yǎng)基,共9個(gè)處理,每個(gè)處理接種10瓶,重復(fù)3次,每瓶培養(yǎng)基接種一個(gè)完整芽;接種45 d后將新萌發(fā)的芽條切割成長度一致的莖段,轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方不變)培養(yǎng),培養(yǎng)周期均為45 d,連續(xù)培養(yǎng)3代(周期),抽檢記錄增殖數(shù)量及生長情況,統(tǒng)計(jì)繼代增殖系數(shù)。

        1.2.4 生根培養(yǎng)試驗(yàn)

        以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以不同倍量大量元素(1/2、1)、不同濃度的生根劑 ABT6(0、0.5、1)mg/L、 IBA (0、 0.5、 1) mg/L、 NAA (0、 0.1、0.2)mg/L組合的配方,設(shè)計(jì)2水平1因素和3水平3因素的正交試驗(yàn),選擇L18(2×37)正交表,對火龍果不定芽進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn),共計(jì)18個(gè)處理。

        將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽的頂芽進(jìn)行切割,每段長度約2 cm,垂直插入生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基,共18個(gè)處理,每個(gè)處理接種10瓶,重復(fù)3次,每瓶接種6個(gè)頂芽;接種后30 d統(tǒng)計(jì)每瓶生根株數(shù)、每株生根數(shù)、平均根長及株高。

        1.2.5 培養(yǎng)條件

        預(yù)培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基,預(yù)培養(yǎng)基、無菌芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂(強(qiáng)度為1 200)3.0 g/L,除增殖培養(yǎng)基需要指定pH值外,其余配方pH均為5.8;生根培養(yǎng)基加入蔗糖15 g/L、瓊脂3.2 g/L、pH 6.0。按常規(guī)要求將各個(gè)培養(yǎng)基進(jìn)行配制、高壓滅菌、靜置冷卻備用。培養(yǎng)室溫度26~28℃,每天光照13~14 h,光照強(qiáng)度2 000~5 000 lx。

        1.2.6 數(shù)據(jù)處理

        使用Excel2007和SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同消毒方式及消毒時(shí)間對外植體消毒效果的影響

        采用不同消毒方式與消毒時(shí)間對火龍果外植體進(jìn)行消毒試驗(yàn),其結(jié)果見表1。消毒效果最好的是處理5,污染率為55.70%;其次是處理6,污染率為57.23%;最差的是處理1,污染率為91.83%。

        通過對以上結(jié)果進(jìn)行單變量雙因素方差分析(表2)可知,雙因素均達(dá)到顯著差異,即不同消毒方式與消毒時(shí)間對外植體污染影響達(dá)到顯著水平。2種消毒方式的消毒效果達(dá)到顯著差異,最好的消毒方式是復(fù)合消毒(即75%酒精+0.1%升汞)。3個(gè)水平消毒時(shí)間的消毒效果也達(dá)到顯著差異,其中消毒時(shí)間為5 min的消毒效果與10和15 min消毒效果達(dá)到顯著性差異,而消毒時(shí)間為10和15 min的消毒效果沒有顯著性差異,因此合適的消毒時(shí)間為10和15 min。

        表1 廣西‘金都一號’火龍果外植體消毒試驗(yàn)結(jié)果

        表2 不同消毒組合及消毒時(shí)間對外植體污染率的影響結(jié)果

        綜上,火龍果外植體消毒最佳方式為處理5和處理6,即先用75%酒精消毒20 s后,再用0.1%升汞消毒10~15 min。

        2.2 不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)無菌芽效果

        以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,附加4個(gè)濃度6-BA與2個(gè)濃度NAA,共計(jì)8種培養(yǎng)基(即8種處理),試驗(yàn)結(jié)果見表3。誘導(dǎo)率最高的是6號培養(yǎng)基,為85.56%;其次是5號培養(yǎng)基,為83.33%;最差的是1號和3號培養(yǎng)基,僅為2.22%和3.33%。

        通過對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行單因變量雙因素方差分析(表4)可知,不同濃度的6-BA對無菌芽誘導(dǎo)結(jié)果影響達(dá)到顯著性差異,6-BA對誘導(dǎo)率影響很大,其中6-BA濃度為8.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好,濃度為1.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最差。不同濃度的NAA對無菌芽誘導(dǎo)結(jié)果的影響未達(dá)到顯著性差異,即NAA對誘導(dǎo)率影響不大。

        綜上,火龍果外植體誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基為:MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L(即6號培養(yǎng)基),誘導(dǎo)的無菌芽如圖1所示。

        表3 廣西‘金都一號’火龍果無菌芽誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

        2.3 不同培養(yǎng)基增殖效果

        不同培養(yǎng)基增殖效果如表5所示。經(jīng)分析可知:平均增殖系數(shù)最高的是6號培養(yǎng)基,為7.13;其次是處理9,為6.67;最差的是1號培養(yǎng)基,僅4.07。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析可知,對增殖系數(shù)影響的主次關(guān)系為A>B>C,初步篩選最優(yōu)組合為A2B3C1(即6號培養(yǎng)基)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證各因素間的顯著性,對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單變量多因素方差分析,結(jié)果顯示各因素F值均小于p(0.05),因此各因素對火龍果增殖系數(shù)的影響均達(dá)到顯著性差異。通過Duncan法對各因素各水平進(jìn)行多重比較(表6)可知,A因素中水平2與水平3差異不顯著,但與水平1差異顯著,其增殖系數(shù)從高到低依次為A3>A2>A1;B因素中3個(gè)水平的增殖系數(shù)均達(dá)到顯著差異水平,其增殖系數(shù)從高到低依次為B3>B2>B1;C因素中水平水平2和水平3差異不顯著,但與水平1差異達(dá)到顯著性,其增殖系數(shù)從高到低依次為C1>C3>C2。通過方差分析篩選出最佳組合為A2B3C1,該組合正是正交試驗(yàn)中增殖系數(shù)最高的6號培養(yǎng)基。

        表4 不同6-BA及NAA濃度對火龍果無菌芽誘導(dǎo)的影響

        圖1 6號培養(yǎng)基誘導(dǎo)的無菌芽

        表5 廣西‘金都一號’火龍果繼代增殖試驗(yàn)結(jié)果

        表6 不同大量元素、6-BA及NAA濃度對火龍果繼代增殖的影響結(jié)果

        綜上,火龍果增殖培養(yǎng)基配方最佳組合為:MS+6-BA 2.0 mg/L(即6號培養(yǎng)基),增殖培養(yǎng)1~3代苗木生長情況如圖2所示。

        2.4 不同培養(yǎng)基生根效果

        生根誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果見表7所示。5號培養(yǎng)基生根率最高,為93.33%;其次是14號培養(yǎng)基,為89.44%;最差的是1、4、13號培養(yǎng)基,生根率不到10%。為了檢驗(yàn)各因素之間的顯著性,對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單變量多因素方差分析,其結(jié)果顯示各因素F值均小于p(0.05),因此各因素對火龍果生根率的影響均達(dá)到顯著性差異。通過利用Duncan法對各因素各水平進(jìn)行多重比較(表8)可知,各因素各水平對火龍果生根率的影響均達(dá)到顯著性差異,最佳組合為A2B2C2D2。由于篩選的最佳組合不在正交試驗(yàn)中,所以補(bǔ)做此組合的驗(yàn)證試驗(yàn),測得生根率為98.56%,高于正交試驗(yàn)中生根率最高組合A1B2C2D2(即5號培養(yǎng)基),苗壯根粗,分枝少。

        圖2 6號培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)(從左至右,依次是第1代、第2代、第3代)

        表7 廣西‘金都一號’火龍果生根試驗(yàn)結(jié)果

        表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA濃度對火龍果生根率的影響結(jié)果

        綜上,火龍果生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方是:MS+ABT60.5 mg/L+I(xiàn)BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根苗木長勢如圖3所示。

        圖3 廣西‘金都一號’生根培養(yǎng)(左圖是5號培養(yǎng)基苗木長勢,右圖是調(diào)整后最佳配方)

        3 討論與結(jié)論

        3.1 外植體污染問題

        外植體消毒一般使用組合消毒方式,其中最常用組合是 75%酒精與 0.1%升汞[4-6,13,16],酒精能夠滲透到菌體內(nèi),使組成菌體的蛋白質(zhì)凝固,從而殺死外植體表面的菌類。值得注意的是酒精濃度以75%消毒效果最佳,過低或過高濃度的酒精殺菌效果會(huì)降低很多。升汞是一種殺菌力很強(qiáng)的殺菌劑,主要靠汞離子進(jìn)入菌類細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞失活或變性,從而達(dá)到消毒作用。微量的升汞還能在細(xì)胞內(nèi)不斷累積并最終對生物體產(chǎn)生毒害作用。因此,使用75%酒精與0.1%升汞組合消毒外植體時(shí),消毒時(shí)間一定要掌握恰當(dāng),因?yàn)橄緞┰跉⑺谰惖耐瑫r(shí)也會(huì)殺死外植體,尤其是外植體切口處、幼嫩部位受毒害最嚴(yán)重[13]。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10~15 min的組合方式對火龍果外植體進(jìn)行表面消毒,污染率為55.70%,這個(gè)組合方式的消毒效果最好。

        火龍果莖段外植體表面光滑,芽眼的刺座處一般污染比較嚴(yán)重,這是因?yàn)檠垦厶庨L有成叢的葉刺,容易窩藏較多的雜菌,雖然用毛刷刷洗,但也難以清洗干凈,消毒劑也較難滲入,因此容易因消毒不徹底而造成污染[6,14]。雖然本研究對火龍果外植體進(jìn)行(如移植大棚內(nèi)培養(yǎng)、毛刷刷洗刺座處、洗潔精浸泡等)預(yù)處理,但是絕大部分污染還是出現(xiàn)在刺座處,因此對火龍果外植體消毒方法還需作進(jìn)一步研究。

        3.2 繼代培養(yǎng)

        火龍果初代培養(yǎng),也叫啟動(dòng)培養(yǎng),需要較高濃度的細(xì)胞分裂素刺激才能分化出無菌芽,當(dāng)然不是越高越好,本研究中當(dāng)6-BA濃度達(dá)到8 mg/L時(shí),誘導(dǎo)率最高,達(dá)到85.47%,低于或高于該濃度,誘導(dǎo)率達(dá)不到50%。相對于初代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)卻不能使用高濃度細(xì)胞分裂素,因?yàn)槿菀壮霈F(xiàn)畸形芽,本研究繼代增殖培養(yǎng)基中6-BA使用濃度為2.0 mg/L時(shí),增殖系數(shù)達(dá)到最高。除了激素外,影響繼代培養(yǎng)的還有大量元素、微量元素及有機(jī)物,本研究就大量元素半量、全量和倍量3種不同濃度進(jìn)行對比試驗(yàn),其中全量和倍量表現(xiàn)突出,綜合考慮以全量為最佳選擇。因此最終篩選出火龍果繼代適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L,增殖系數(shù)為7.13。本研究結(jié)果與很多報(bào)道的結(jié)果不同[6-7,10],如與周傳明等[6]研究結(jié)果剛好相反,其誘導(dǎo)腋芽最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,最佳增殖和繼代培養(yǎng)基均是MS+12.0mg/L+NAA 0.1 mg/L,這可能是不同品種適合不同的培養(yǎng)配方。

        3.3 生根培養(yǎng)

        火龍果為多年生肉質(zhì)植物,生長旺盛,萌芽力和發(fā)枝力較強(qiáng),易生氣生根,此生物特性有利于其組培生根培養(yǎng)[15],因此火龍果屬于比較容易誘導(dǎo)根系的樹種,但是也容易誘導(dǎo)出過多氣生根、分枝,影響生根苗質(zhì)量?;瘕埞T導(dǎo)培養(yǎng)基中一般大量元素為半量,即 1/2[4,11,13-14],主要是因?yàn)闋I養(yǎng)元素減少可抑制側(cè)芽萌發(fā),從而促進(jìn)根系生長,達(dá)到誘導(dǎo)出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培養(yǎng)基生根率達(dá)到93.33%,苗壯根粗,分枝少,效果也不錯(cuò),但是通過分析及驗(yàn)證,最終篩選的最佳配方是MS+ABT60.5 mg/L+I(xiàn)BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根率達(dá)到98.56%,苗壯根粗,分枝少。因此不同品種對培養(yǎng)基配方要求不同,需要科技人員通過科學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行篩選。

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