李清香 吳紅英
(欽州市林業(yè)科學研究所 廣西欽州535099)
火龍果(Hylocereus undatus),植物學名是量天尺 [Hylocereus undatus(Haw.) Britt.et Rose],是仙人掌科(Seleniereus)量天尺屬[Hylocereus(Berg.) Britt.et Rose] 多年生攀援肉質(zhì)灌木,又名紅龍果、青龍果、仙蜜果、玉龍果,原產(chǎn)中美洲至南美洲北部,世界各地廣泛栽培[1]?;瘕埞蚱渫獗砣赓|(zhì)鱗片似蛟龍外鱗而得名,具有豐富的營養(yǎng)價值,是一種低熱量、高纖維的水果[2-3],符合現(xiàn)代人對營養(yǎng)、健康的需求,是近年來受消費者和種植戶廣泛關注的一種新興熱帶亞熱帶果樹。廣西‘金都一號’火龍果(桂審果2016007號)是廣西南寧金之都農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司從中南美洲火龍果原種與紅肉種的雜交后代中選育而成。該品種屬于紅皮紅肉,自花授粉,不易裂果,果實甜度高,在廣西、廣東和海南廣泛種植,是市場熱銷品種之一。由于種植面積逐年擴大,對火龍果苗木的需求也不斷增加。采用種子繁殖,繁殖后代易變異,無法保持品種的優(yōu)良特性。采用無性繁殖,可以保持品種的優(yōu)良特性,目前火龍果育苗方式就是以扦插或嫁接為主的無性繁殖。但是傳統(tǒng)的扦插育苗和嫁接育苗,繁殖數(shù)量完全不夠市場的需求,而植物組織培養(yǎng)方式卻可以在短時間內(nèi)繁育大量品質(zhì)保持一致的苗木,因此研究火龍果組培育苗技術顯得尤為重要。中國火龍果組培技術研究起步比較晚,2000年以后才開始有零星報道[4-15],火龍果組培技術開發(fā)的成功試驗中,大多數(shù)研究以火龍果莖段為材料,開展外植體消毒、無菌芽誘導、繼代增殖和生根誘導試驗,篩選最佳培養(yǎng)方式方法,建立火龍果組培技術體系。隨著火龍果品質(zhì)的不斷提升,近五年來火龍果開始到得到大眾青睞,商業(yè)栽培的優(yōu)質(zhì)品種,如‘金都一號’、‘桂紅龍’、‘大紅’等,經(jīng)濟效益高、品質(zhì)穩(wěn)定,種植面積逐年增加。由于‘金都一號’是新選育出來的且已通過區(qū)域?qū)彾ǖ钠贩N,市場需求量大,通過組培快繁技術可以有效提供品質(zhì)一致的苗木。通過查閱文獻可知,近年來有關‘金都一號’組培技術的研究報道很少,僅有洪青梅等[16]有針對性地對該品種進行外植體誘導的研究,而未有其系統(tǒng)的研究成果,無法建立‘金都一號’組培技術體系。因此,很有必要在前人的研究基礎上開展‘金都一號’組培技術的研究,初步建立一套‘金都一號’組培技術體系,為后續(xù)的研究提供重要參考資料,從而為新品種的推廣提供優(yōu)質(zhì)苗木。
廣西欽州市林業(yè)科學研究所于2016年引種‘金都一號’,為了保證母株的安全,杜絕外界病毒的感染,引進的‘金都一號’種植于大棚內(nèi)。本研究的所需材料均出自其新萌芽的莖段,將新萌芽的莖段剪下來帶回實驗室,先用清水沖洗,同時用毛刷輕輕刷洗刺座位置,將外植體表面的泥沙沖洗干凈,然后瀝干水份,裝入干凈的杯子備用。
1.2.1 外植體消毒試驗
本試驗選擇75%酒精和0.1%升汞2種常規(guī)的消毒劑,采用2種消毒方式(0.1%升汞、75%酒精+0.1%升汞),其中升汞消毒時間分別為5、10、15min,75%酒精消毒時間為20 s。
將處理好的外植體放到超凈工作臺上,按設計方案依次操作,最后用無菌水清洗3~4次,每次沖洗1~2 min,瀝干表面水分;切掉外植體切口壞死的部分肉莖,然后把外植體切割成每段帶有2~3個刺座的莖段,垂直插入預培養(yǎng)基中,每個處理接種20瓶,重復3次,每瓶接種1個莖段;接種后7 d檢查污染情況,統(tǒng)計污染數(shù)。
1.2.2 無菌芽誘導試驗
以MS為基礎培養(yǎng)基,附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑 6-BA (1、5、8、11) mg/L、NAA (1、0.1) mg/L,對外植體進行誘導試驗,觀察不同配方對外植體誘導無菌芽的效果。將經(jīng)過預培養(yǎng)后未污染、外植體顏色未變、切口愈傷組織正常的莖段進行切割,切割時以莖段棱柱的中心點為切割點,把棱柱縱向切割成3個棱邊,然后再橫向切割成帶1個刺座的組織塊,轉(zhuǎn)入無菌芽誘導培養(yǎng)基,注意刺座不要插入培養(yǎng)基中,以免影響萌芽;每個處理接種30瓶,重復3次,每瓶接種1個組織塊;接種后40 d觀察無菌芽萌發(fā)情況,統(tǒng)計無菌芽誘導成功數(shù)。
1.2.3 增殖培養(yǎng)試驗
以MS為基礎培養(yǎng)基,以不同倍量大量元素(1/2、1、3/2)、不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA(0.5、1、2) mg/L、NAA (0、0.1、0.2) mg/L組合的配方,設計3個因素各3個水平的正交試驗,選擇L9(34)正交表,共計9個處理,對無菌芽進行增殖培養(yǎng)試驗,每個配方配制30瓶培養(yǎng)基;將無菌芽接種到增殖培養(yǎng)基,共9個處理,每個處理接種10瓶,重復3次,每瓶培養(yǎng)基接種一個完整芽;接種45 d后將新萌發(fā)的芽條切割成長度一致的莖段,轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方不變)培養(yǎng),培養(yǎng)周期均為45 d,連續(xù)培養(yǎng)3代(周期),抽檢記錄增殖數(shù)量及生長情況,統(tǒng)計繼代增殖系數(shù)。
1.2.4 生根培養(yǎng)試驗
以MS為基礎培養(yǎng)基,以不同倍量大量元素(1/2、1)、不同濃度的生根劑 ABT6(0、0.5、1)mg/L、 IBA (0、 0.5、 1) mg/L、 NAA (0、 0.1、0.2)mg/L組合的配方,設計2水平1因素和3水平3因素的正交試驗,選擇L18(2×37)正交表,對火龍果不定芽進行生根誘導試驗,共計18個處理。
將增殖培養(yǎng)得到的叢生芽的頂芽進行切割,每段長度約2 cm,垂直插入生根誘導培養(yǎng)基,共18個處理,每個處理接種10瓶,重復3次,每瓶接種6個頂芽;接種后30 d統(tǒng)計每瓶生根株數(shù)、每株生根數(shù)、平均根長及株高。
1.2.5 培養(yǎng)條件
預培養(yǎng)基為無激素的MS培養(yǎng)基,預培養(yǎng)基、無菌芽誘導培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基均加入蔗糖30 g/L、瓊脂(強度為1 200)3.0 g/L,除增殖培養(yǎng)基需要指定pH值外,其余配方pH均為5.8;生根培養(yǎng)基加入蔗糖15 g/L、瓊脂3.2 g/L、pH 6.0。按常規(guī)要求將各個培養(yǎng)基進行配制、高壓滅菌、靜置冷卻備用。培養(yǎng)室溫度26~28℃,每天光照13~14 h,光照強度2 000~5 000 lx。
1.2.6 數(shù)據(jù)處理
使用Excel2007和SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
采用不同消毒方式與消毒時間對火龍果外植體進行消毒試驗,其結果見表1。消毒效果最好的是處理5,污染率為55.70%;其次是處理6,污染率為57.23%;最差的是處理1,污染率為91.83%。
通過對以上結果進行單變量雙因素方差分析(表2)可知,雙因素均達到顯著差異,即不同消毒方式與消毒時間對外植體污染影響達到顯著水平。2種消毒方式的消毒效果達到顯著差異,最好的消毒方式是復合消毒(即75%酒精+0.1%升汞)。3個水平消毒時間的消毒效果也達到顯著差異,其中消毒時間為5 min的消毒效果與10和15 min消毒效果達到顯著性差異,而消毒時間為10和15 min的消毒效果沒有顯著性差異,因此合適的消毒時間為10和15 min。
表1 廣西‘金都一號’火龍果外植體消毒試驗結果
表2 不同消毒組合及消毒時間對外植體污染率的影響結果
綜上,火龍果外植體消毒最佳方式為處理5和處理6,即先用75%酒精消毒20 s后,再用0.1%升汞消毒10~15 min。
以MS為基礎培養(yǎng)基,附加4個濃度6-BA與2個濃度NAA,共計8種培養(yǎng)基(即8種處理),試驗結果見表3。誘導率最高的是6號培養(yǎng)基,為85.56%;其次是5號培養(yǎng)基,為83.33%;最差的是1號和3號培養(yǎng)基,僅為2.22%和3.33%。
通過對以上數(shù)據(jù)進行單因變量雙因素方差分析(表4)可知,不同濃度的6-BA對無菌芽誘導結果影響達到顯著性差異,6-BA對誘導率影響很大,其中6-BA濃度為8.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導效果最好,濃度為1.0 mg/L的培養(yǎng)基誘導效果最差。不同濃度的NAA對無菌芽誘導結果的影響未達到顯著性差異,即NAA對誘導率影響不大。
綜上,火龍果外植體誘導最適合的培養(yǎng)基為:MS附加6-BA 8.0 mg/L和NAA 0.1 mg/L(即6號培養(yǎng)基),誘導的無菌芽如圖1所示。
表3 廣西‘金都一號’火龍果無菌芽誘導試驗結果
不同培養(yǎng)基增殖效果如表5所示。經(jīng)分析可知:平均增殖系數(shù)最高的是6號培養(yǎng)基,為7.13;其次是處理9,為6.67;最差的是1號培養(yǎng)基,僅4.07。對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析可知,對增殖系數(shù)影響的主次關系為A>B>C,初步篩選最優(yōu)組合為A2B3C1(即6號培養(yǎng)基)。為了進一步驗證各因素間的顯著性,對正交試驗結果進行單變量多因素方差分析,結果顯示各因素F值均小于p(0.05),因此各因素對火龍果增殖系數(shù)的影響均達到顯著性差異。通過Duncan法對各因素各水平進行多重比較(表6)可知,A因素中水平2與水平3差異不顯著,但與水平1差異顯著,其增殖系數(shù)從高到低依次為A3>A2>A1;B因素中3個水平的增殖系數(shù)均達到顯著差異水平,其增殖系數(shù)從高到低依次為B3>B2>B1;C因素中水平水平2和水平3差異不顯著,但與水平1差異達到顯著性,其增殖系數(shù)從高到低依次為C1>C3>C2。通過方差分析篩選出最佳組合為A2B3C1,該組合正是正交試驗中增殖系數(shù)最高的6號培養(yǎng)基。
表4 不同6-BA及NAA濃度對火龍果無菌芽誘導的影響
圖1 6號培養(yǎng)基誘導的無菌芽
表5 廣西‘金都一號’火龍果繼代增殖試驗結果
表6 不同大量元素、6-BA及NAA濃度對火龍果繼代增殖的影響結果
綜上,火龍果增殖培養(yǎng)基配方最佳組合為:MS+6-BA 2.0 mg/L(即6號培養(yǎng)基),增殖培養(yǎng)1~3代苗木生長情況如圖2所示。
生根誘導試驗結果見表7所示。5號培養(yǎng)基生根率最高,為93.33%;其次是14號培養(yǎng)基,為89.44%;最差的是1、4、13號培養(yǎng)基,生根率不到10%。為了檢驗各因素之間的顯著性,對試驗數(shù)據(jù)進行單變量多因素方差分析,其結果顯示各因素F值均小于p(0.05),因此各因素對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異。通過利用Duncan法對各因素各水平進行多重比較(表8)可知,各因素各水平對火龍果生根率的影響均達到顯著性差異,最佳組合為A2B2C2D2。由于篩選的最佳組合不在正交試驗中,所以補做此組合的驗證試驗,測得生根率為98.56%,高于正交試驗中生根率最高組合A1B2C2D2(即5號培養(yǎng)基),苗壯根粗,分枝少。
圖2 6號培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)(從左至右,依次是第1代、第2代、第3代)
表7 廣西‘金都一號’火龍果生根試驗結果
表8 不同大量元素MS、ABT6、IBA及NAA濃度對火龍果生根率的影響結果
綜上,火龍果生根誘導最佳培養(yǎng)基配方是:MS+ABT60.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根苗木長勢如圖3所示。
圖3 廣西‘金都一號’生根培養(yǎng)(左圖是5號培養(yǎng)基苗木長勢,右圖是調(diào)整后最佳配方)
外植體消毒一般使用組合消毒方式,其中最常用組合是 75%酒精與 0.1%升汞[4-6,13,16],酒精能夠滲透到菌體內(nèi),使組成菌體的蛋白質(zhì)凝固,從而殺死外植體表面的菌類。值得注意的是酒精濃度以75%消毒效果最佳,過低或過高濃度的酒精殺菌效果會降低很多。升汞是一種殺菌力很強的殺菌劑,主要靠汞離子進入菌類細胞內(nèi),使細胞失活或變性,從而達到消毒作用。微量的升汞還能在細胞內(nèi)不斷累積并最終對生物體產(chǎn)生毒害作用。因此,使用75%酒精與0.1%升汞組合消毒外植體時,消毒時間一定要掌握恰當,因為消毒劑在殺死菌類的同時也會殺死外植體,尤其是外植體切口處、幼嫩部位受毒害最嚴重[13]。本研究使用75%酒精消毒20 s、再用0.1%升汞消毒10~15 min的組合方式對火龍果外植體進行表面消毒,污染率為55.70%,這個組合方式的消毒效果最好。
火龍果莖段外植體表面光滑,芽眼的刺座處一般污染比較嚴重,這是因為芽眼處長有成叢的葉刺,容易窩藏較多的雜菌,雖然用毛刷刷洗,但也難以清洗干凈,消毒劑也較難滲入,因此容易因消毒不徹底而造成污染[6,14]。雖然本研究對火龍果外植體進行(如移植大棚內(nèi)培養(yǎng)、毛刷刷洗刺座處、洗潔精浸泡等)預處理,但是絕大部分污染還是出現(xiàn)在刺座處,因此對火龍果外植體消毒方法還需作進一步研究。
火龍果初代培養(yǎng),也叫啟動培養(yǎng),需要較高濃度的細胞分裂素刺激才能分化出無菌芽,當然不是越高越好,本研究中當6-BA濃度達到8 mg/L時,誘導率最高,達到85.47%,低于或高于該濃度,誘導率達不到50%。相對于初代培養(yǎng),繼代培養(yǎng)卻不能使用高濃度細胞分裂素,因為容易出現(xiàn)畸形芽,本研究繼代增殖培養(yǎng)基中6-BA使用濃度為2.0 mg/L時,增殖系數(shù)達到最高。除了激素外,影響繼代培養(yǎng)的還有大量元素、微量元素及有機物,本研究就大量元素半量、全量和倍量3種不同濃度進行對比試驗,其中全量和倍量表現(xiàn)突出,綜合考慮以全量為最佳選擇。因此最終篩選出火龍果繼代適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L,增殖系數(shù)為7.13。本研究結果與很多報道的結果不同[6-7,10],如與周傳明等[6]研究結果剛好相反,其誘導腋芽最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L,最佳增殖和繼代培養(yǎng)基均是MS+12.0mg/L+NAA 0.1 mg/L,這可能是不同品種適合不同的培養(yǎng)配方。
火龍果為多年生肉質(zhì)植物,生長旺盛,萌芽力和發(fā)枝力較強,易生氣生根,此生物特性有利于其組培生根培養(yǎng)[15],因此火龍果屬于比較容易誘導根系的樹種,但是也容易誘導出過多氣生根、分枝,影響生根苗質(zhì)量。火龍果生根誘導培養(yǎng)基中一般大量元素為半量,即 1/2[4,11,13-14],主要是因為營養(yǎng)元素減少可抑制側芽萌發(fā),從而促進根系生長,達到誘導出根的效果。本研究中大量元素使用半量的培養(yǎng)基生根率達到93.33%,苗壯根粗,分枝少,效果也不錯,但是通過分析及驗證,最終篩選的最佳配方是MS+ABT60.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根率達到98.56%,苗壯根粗,分枝少。因此不同品種對培養(yǎng)基配方要求不同,需要科技人員通過科學試驗進行篩選。