馬垚 張磊 黃宇思 劉鑫

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinomas,OSCC)占口腔惡性腫瘤的90%以上[1]，且發(fā)病率高、死亡率高、存活率低[2]，目前臨床以手術(shù)、化療、放療的綜合序列治療為主要治療手段[3]。光動力治療(photodynamic therapy，PDT)的原理是腫瘤組織選擇性攝取并儲存光敏劑，在特定波長的激光照射下，在有氧環(huán)境內(nèi)發(fā)生一系列光動力反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡和自噬[4]。華卟啉鈉(sinoporphyrin sodium,DVDMS)是方起程教授研制的一種新型卟啉類光敏劑，它是由已應(yīng)用于臨床的第一代光敏劑Photofrin提純的抗癌光敏活性部分，相同的抗癌光敏活性，僅為Photofrin用量的1/10，具有對腫瘤組織靶向性強，單態(tài)氧產(chǎn)率高，暗毒性低等特點,迄今全世界已有數(shù)萬例患者接受Photofrin治療，涉及的癌癥多達(dá)數(shù)十種[5]。研究證明Photofrin光動力治療舌癌，能夠取得不錯的臨床療效[6]。DVDMS作為一種新型卟啉類光敏劑，和其他卟啉類光敏劑一樣，相比于正常細(xì)胞，能夠更多的被腫瘤細(xì)胞所吸收[7-9]。本研究探討DVDMS-PDT治療對口腔舌鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響，期望為口腔癌的治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及設(shè)備

華卟啉鈉(哈工大聲光動力實驗室提供)，635 nm激光器(哈工大聲光動力實驗室提供)(波長635 nm，連續(xù)輸出方式，光功率密度15 mW/cm2),倒置顯微鏡(Nikon，日本)；多功能酶標(biāo)儀(MD SpectraMax M3，美國)；流式細(xì)胞儀(BD，美國)。FBS(Gibco,Thermo Fisher公司,美國)；胰蛋白酶、AnnexinV-PI雙染試劑盒(碧云天公司)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(HyClone公司，美國)；CCK-8(同仁公司，日本)。SCC-15細(xì)胞由哈醫(yī)大二院贈予。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-15用含1%青鏈霉素混合液、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。SCC-15細(xì)胞2～3 d以1∶3傳代1 次，傳代3代后用于正式實驗。

1.2.2 DVDMS的配制 在避光條件下，將DVDMS粉末溶于雙蒸水中配制成8 mg/ml，后續(xù)實驗所需的DVDMS均由無血清DMEM稀釋而成。

1.2.3 CCK-8法檢測DVDMS細(xì)胞毒性 SCC-15細(xì)胞以細(xì)胞密度為1×104個/孔接種到96孔板，藥物濃度為0(空白對照組)、0.1、0.5、1、2、4、6、8 μg/ml共8 組,24 h后加入CCK-8試劑10 μl/孔，避光培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值。按公式計算細(xì)胞存活率(%)=(實驗組平均A值-本底組平均A值)/(對照組平均A值-本底組平均A值)×100%，重復(fù)3 次實驗。

1.2.4 DVDMS的細(xì)胞孵育時間 種板同上，加入藥物濃度為2 μg/ml的DVDMS 100 μl，避光孵育0(對照組)、1、2、3、4、5、6,、7、8、9 h共10 組，使用含有底度功能的酶標(biāo)儀M3檢測吸光度(A)值。其熒光強度用實驗組A值與對照組A值的差值來表示。以細(xì)胞密度為1×106個/皿將SCC-15細(xì)胞接種到小皿內(nèi)，加入藥物濃度為2 μg/ml的DVDMS 2 ml，避光孵育0、2、6、8 h共4 組，熒光顯微鏡下觀察其熒光強度。

1.2.5 CCK-8法檢測DVDMS-PDT處理后細(xì)胞存活率 種板同上，將細(xì)胞隨機分成對照組(Control)，單藥組(DVDMS alone)，單光組(Light alone)和DVDMS-PDT組，單藥組和DVDMS-PDT組避光加入100 μl DVDMS濃度分別為0.5、1、2 μg/ml，對照組和單光組加入等量的無血清培養(yǎng)基，避光孵育6 h后單光組和DVDMS-PDT組的光照劑量為0.9、1.8、3.6、5.4 J/cm2。光照處理后，繼續(xù)孵育24 h，計算細(xì)胞存活率。

1.2.6 Annexin V-PI檢測細(xì)胞凋亡 以細(xì)胞密度為1×106個/孔將SCC-15細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，分組同上，單藥組和DVDMS-PDT組避光加入2 μg/ml的DVDMS 3 ml,對照組和單光組加入等量的無血清培養(yǎng)基，避光孵育6 h后單光組和DVDMS-PDT組光照劑量為3.6 J/cm2。處理24 h后，Annexin V-PI染色處理，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 劃痕實驗分析細(xì)胞遷移能力 細(xì)胞分組及處理同1.2.6。在孔中央縱軸方向用10 μl的槍頭劃出一條劃痕，分別于0、48 h取樣，倒置顯微鏡下觀察劃痕處細(xì)胞遷移狀態(tài)，計算劃痕愈合百分比=(最初劃痕面積-48 h時劃痕面積)/最初劃痕面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 DVDMS對SCC-15的細(xì)胞毒性

4、6、8 μg/ml組細(xì)胞存活率分別為(89.10±2.35)%、(86.94±2.54)%、(83.96±2.22)%，低于對照組的(100±3.17)%(P<0.05)。2 μg/ml組的細(xì)胞存活率為(93.72±2.24)%。實驗結(jié)果表明DVDMS濃度≤2 μg/ml對SCC-15細(xì)胞的細(xì)胞存活率沒有明顯影響，當(dāng)達(dá)到一定濃度(≥4 μg/ml)后，隨著DVDMS濃度的升高SCC-15細(xì)胞的細(xì)胞存活率逐漸下降(圖 1)。

圖 1 CCK-8檢測DVDMS毒性

2.2 DVDMS的細(xì)胞孵育時間

在0～6 h之間，隨著孵育時間的增長，細(xì)胞熒光強度也相應(yīng)增強，6 h時達(dá)到頂峰，隨后隨著孵育時間的增加細(xì)胞熒光強度沒有明顯變化(圖 2)。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強度，發(fā)現(xiàn)孵育6 h和8 h的細(xì)胞熒光強度明顯強于孵育2 h的，而6 h和8 h的熒光強度沒有顯著的差異(圖 2)，從而進一步驗證了DVDMS在SCC-15細(xì)胞內(nèi)孵育6 h為最佳。

圖 2 DVDMS的熒光強度與細(xì)胞孵育時間 (×200)

Fig 2 The fluorescence intensity of DVDMS incubation time with the SCC-15 cells (×200)

2.3 DVDMS-PDT處理后SCC-15細(xì)胞存活率

光敏劑的劑量和光照強度決定了光動力療法不同的細(xì)胞毒效應(yīng)。CCK-8法檢測不同DVDMS濃度結(jié)合不同光劑量對SCC-15細(xì)胞的毒效應(yīng)(圖 3)，單藥組和單光組的細(xì)胞存活率與空白對照組相比沒有顯著性差異，說明單純的低濃度DVDMS或單純的低劑量光照對SCC-15細(xì)胞無明顯的抑制作用。當(dāng)DVDMS濃度為2 μg/ml，光照劑量為0.9、1.8、3.6、5.4 J/cm2，其細(xì)胞存活率分別為(83.90±2.86)%、(73.10±3.55)%、(58.43±4.95)%、(33.51±3.50)%，當(dāng)光照劑量為3.6 J/cm2，DVDMS的濃度分別為0.5、1、2 μg/ml時，其細(xì)胞存活率為(88.52±2.13)%、(71.74±2.69)%、(58.43±4.95)%，表明DVDMS-PDT對SCC-15細(xì)胞毒效應(yīng)呈現(xiàn)出藥物劑量和光照強度依賴性。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

利用流式細(xì)胞儀檢測單純對照組、單光組、單藥組、DVDMS-PDT組的細(xì)胞凋亡率分別為(10.19±1.17)%、(11.99±1.13)%、(11.98±0.69)%、(42.79±3.03)%(圖 4)。DVDMS-PDT組與單純對照組、單光組、單藥組相比,P<0.001。而單光組和單藥組與單純對照組相比P>0.05。

與對照組相比，*P<0.05 ,**P<0.01 ,***P<0.001

圖 3 DVDMS-PDT處理后細(xì)胞存活率

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vscontrol group

Fig 3 Cell viability after DVDMS-PDT treatment

圖 4 流式檢測SCC-15細(xì)胞凋亡

2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力

單純對照組、單藥組、單光組較多細(xì)胞遷移到劃痕區(qū)域，而DVDMS-PDT組細(xì)胞遷移相較其他3 組較少(圖 5)。單純對照組、單藥組、單光組、DVDMS-PDT組的劃痕愈合百分比分別為(81.60±5.14)%、(74.31±10.85)%、(77.62±6.54)%、(18.68±10.04)%。DVDMS-PDT組與單純對照組、單光組、單藥組相比P<0.05。單光組和單藥組與單純對照組相比P>0.05。

圖 5 劃痕實驗檢測SCC-15細(xì)胞的遷移能力 (×100)

Fig 5 Migration ability of the SCC-15 cell detected by a scrath assay (×100)

3 討 論

舌鱗癌是最常見的口腔癌，常發(fā)生早期頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高。據(jù)報道，目前臨床上應(yīng)用PDT治療頭頸部腫瘤均取得不錯的療效[10-11]，尤其以淺表性腫瘤(如口腔舌鱗癌)效果更佳[12-13]。有研究表明，已應(yīng)用于臨床的卟啉類光敏劑5-ALA對于惡性膠質(zhì)瘤患者而言，會選擇性的聚集在腫瘤組織內(nèi)，而在正常腦組織內(nèi)聚集相對較少[14]。5-ALA、Photofrin對皮膚癌、肺癌、宮頸癌等均取得了一定的療效[15-17]。而本實驗所應(yīng)用的光敏劑DVDMS目前雖尚未在臨床上應(yīng)用，但其抗癌作用在動物實驗上也取得了不錯的成果[7,18]，并且正常治療劑量的華卟啉鈉并無明顯的不良反應(yīng)[19]。事實上，光動力對口腔疾病的作用并不僅限于口腔癌的治療，它還有明顯的防齲作用[20]。本實驗在既往研究的基礎(chǔ)上，主要研究DVDMS-PDT對口腔舌鱗癌的殺傷作用。

PDT的療效受光敏劑種類和濃度、光能量密度和組織氧濃度等因素的影響。光敏劑的孵育時間能夠影響細(xì)胞內(nèi)光敏劑的量，因而也是影響PDT療效的重要因素，本實驗研究證明光敏劑DVDMS在SCC-15細(xì)胞內(nèi)孵育6 h達(dá)到飽和。

為進一步研究DVDMS-PDT對SCC-15細(xì)胞的殺傷作用，本實驗采用不同光敏劑濃度及不同光照劑量處理SCC-15細(xì)胞。CCK-8結(jié)果表明:DVDMS-PDT治療能有效抑制SCC-15細(xì)胞增殖，且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即隨著藥物濃度的升高和光照劑量的增大，細(xì)胞的殺傷作用越明顯。DVDMS-PDT能夠殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機制為DVDMS能夠選擇性積聚在腫瘤組織，經(jīng)光照激發(fā)產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，在這種光動力反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量活性氧物質(zhì)，這些活性氧物質(zhì)是DVDMS-PDT殺傷作用的關(guān)鍵[18]。活性氧的產(chǎn)生能夠引起細(xì)胞凋亡、F-actin微絲解聚[21]和蛋白質(zhì)的氧化損傷[22]，最終起到殺傷腫瘤組織的作用。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，單純的DVDVMS及單純的光照治療的凋亡率無明顯差異(P>0.05)，而DVDMS-PDT處理后SCC-15細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.001),這一結(jié)果說明了DVDMS介導(dǎo)的PDT治療能夠誘導(dǎo)人口腔舌鱗狀細(xì)胞癌SCC-15細(xì)胞發(fā)生凋亡。關(guān)于DVDMS-PDT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能有以下途徑：①線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑(內(nèi)源性途徑)：受Bcl-2家族蛋白的調(diào)控，線粒體膜通透性改變，使細(xì)胞色素C釋放進入胞質(zhì)，與凋亡相關(guān)因子Apaf-1結(jié)合，活化的Apaf-1激活Caspase-9，通過Caspase-9激活下游的Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。②死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑(外源性途徑)：死亡受體Fas與配體FasL結(jié)合后，活化的Fas的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)相互積聚并與接頭蛋白分子(FADD)相互結(jié)合。FADD的死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(death effector domain，DED)與Caspase-8的DED結(jié)合，激活Caspase-8，形成有Fas、FasL、FADD、Caspase-8組成的復(fù)合物。激活Caspase-3,引發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。已有研究證實[13]，DVDMS-PDT治療可以造成線粒體膜電位的改變。

細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示DVDMS-PDT組的傷口愈合百分比明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而單光組和單藥組與對照組之間的傷口愈合百分比無明顯差異(P>0.05),由此可見DVDMS-PDT治療顯著抑制了SCC-15細(xì)胞的遷移能力。金屬基質(zhì)蛋白酶(metrix metalloproteinases，MMPs)能降解位于腫瘤細(xì)胞表面及周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞阻礙細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的天然屏障,在惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[23]。DVDMS-PDT能夠抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力可能與MMPs表達(dá)受到抑制有關(guān)。

本實驗主要進行了DVDMS-PDT對口腔舌鱗癌殺傷作用的體外實驗，其具體的殺傷機制及在動物體內(nèi)的殺傷作用有待繼續(xù)研究。