周芳 朱勇 唐成芳 王丹楊 李雪 黃碩

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)具有多向分化潛能，為近期組織工程中骨骼損傷修復(fù)的研究熱點[1]。研究報道BMMSCs被應(yīng)用于口腔牙周損傷的修復(fù)[2]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是具有促進(jìn)血管內(nèi)皮生長及生成的糖蛋白，其參與骨愈合相關(guān)過程。研究表明，VEGF作為旁分泌因子促進(jìn)骨折的修復(fù)、重塑過程，為骨形成或修復(fù)的正性調(diào)節(jié)因子[3-4]。本研究擬將二者優(yōu)勢結(jié)合，通過轉(zhuǎn)染BMMSCs使其VEGF過表達(dá)并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，制作誘導(dǎo)成骨膜片，觀察VEGF過表達(dá)的膜片對大鼠牙槽骨損傷修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠40 只，體重(200±20) g ，由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號(201722172)。

1.1.2 試劑 α-MEM培養(yǎng)基(Sigma公司,美國)；胎牛血清(FBS)(GIBCO公司,美國)；胰蛋白酶(Hyclone公司,美國)；VEGF過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉瑪公司)；VEGF抗體、GAPDH抗體及羊抗小鼠IgG-HRP 抗體(CST公司,美國)；維生素C、茜素紅、油紅O、多聚甲醛、無水乙醇及其他分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.1.3 主要儀器 PIPETMAN L微量可調(diào)加樣器(Gilson公司,法國)；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機(Beckman Coulter公司,美國)；CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司,日本)；Thermo 311二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司，美國)；BCM-1300A超凈工作臺(蘇凈安泰公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMMSCs提取、分離培養(yǎng)及鑒定 取4 只SD大鼠脫臼處死，按文獻(xiàn)[1]方法提取分離BMMSCs，細(xì)胞以10% FBS 的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃、 5% CO2及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中，經(jīng)48 h培養(yǎng)貼壁的細(xì)胞即為BMMSCs。按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 BMMSCs VEGF過表達(dá)轉(zhuǎn)染、篩選及驗證 細(xì)胞匯合度達(dá)70% 時開始轉(zhuǎn)染，參考文獻(xiàn)[6]以說明書方法將帶有表達(dá)綠色熒光的空載載體病毒液和VEGF過表達(dá)載體病毒液加入BMMSCs中，分別命名為對照組和過表達(dá)組，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 h,棄去上清并用PBS洗3 遍，加入全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代1 周后用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，熒光顯微鏡和Western blot實驗驗證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 成骨膜片的制作及驗證 將篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過表達(dá)組和對照組BMMSCs胰蛋白酶消化5 min, 1 000 r/min離心10 min后以含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基重懸計數(shù)。按每孔3×105個/孔接種于6 孔板。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h時以10%FBS、50 mg/L維生素和α-MEM培養(yǎng)基配備膜誘導(dǎo)液，更換培養(yǎng)基為成膜誘導(dǎo)液，后間隔2 d換液1 次，16 d完成膜片制備，獲得的2 組膜片部分用來Vonkossa染色，顯微鏡下觀察膜片的組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4 建立牙槽骨損傷模型并植入細(xì)胞膜片 取36 只SD大鼠，以40 mg/L的2%的戊巴比妥鈉麻醉，手術(shù)暴露大鼠上頜骨并用牙科鉆在上頜骨兩側(cè)第一磨牙近中舌側(cè)牙槽骨造3 mm×3 mm×1 mm長方體骨缺損區(qū)域。大鼠上頜牙槽骨缺損處植入過表達(dá)組和對照組細(xì)胞膜片。同時以不植入細(xì)胞膜片設(shè)立空白組，每組12 只大鼠。而后縫合黏膜，術(shù)后注射抗生素3 d。

1.2.5 Micro-CT掃描 分別在術(shù)后第2、4、 6、 8周脫頸處死大鼠3 只， 取上頜骨置于4%的多聚甲醛固定， Micro-CT掃描并觀察牙槽骨缺損處成骨情況。

1.2.6 用Western blot法檢測VEGF蛋白表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)匯合至70%，按實驗要求處理細(xì)胞后，按文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，及封閉。按需求加入VEGF抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃溫育過夜。次日，TBST洗膜3 次， 加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，用Syngene Imaging System進(jìn)行成像，用Image J對蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs及過表達(dá)VEGF的BMMSCs的形態(tài)及鑒定

分離傳代后的BMMSCs形態(tài)多為菱形，生長狀態(tài)良好。過表達(dá)組和對照組BMMSCs在熒光顯微鏡下可見明顯綠色熒光。Western blot實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比，過表達(dá)組BMMSCs中VEGF表達(dá)提高(83.1±4.8)%(P<0.05)(圖 1)。

圖 1 各組BMMSCs形態(tài)、轉(zhuǎn)染后熒光和蛋白表達(dá)情況

2.2 細(xì)胞膜片制備后鑒定

過表達(dá)組和對照組膜片進(jìn)行Vonkossa 染色，發(fā)現(xiàn)2 組膜片礦化結(jié)節(jié)染色陽性，如圖 2黑色箭頭所示，可見細(xì)胞外局部有黑色鈣結(jié)節(jié)。

2.3 牙槽骨損傷修復(fù)效果

與空白組相比，隨時間延長對照組牙槽骨修復(fù)效果較好，在第4和8 周結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，隨時間延長過表達(dá)組牙槽骨修復(fù)效果較好，在4、6和8 周結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義，數(shù)據(jù)見表 1。

Tab 1 Changes in bone volume fraction in the 3 groups (n=3， %，

注： 與空白對照組比較， ①P<0.05； 與對照組比較， ②P<0.05

圖 2 2 組BMMSCs膜片Vonkossa 染色結(jié)果

3 討 論

拔牙、牙齒長期缺失或增齡性變化等原因，都會導(dǎo)致牙槽骨缺損，而牙槽骨缺損為后續(xù)牙齒修復(fù)帶來了很多困難。研究發(fā)現(xiàn)，前傾及水平阻生的下頜第三磨牙拔除后會造成下頜第二磨牙遠(yuǎn)中牙槽骨的缺損[8]。傳統(tǒng)骨損傷的修復(fù)為自體或同種異體移植術(shù)，因存在供區(qū)并發(fā)癥和免疫反應(yīng)，所以急需新的骨損傷修復(fù)方法。組織工程學(xué)的興起為骨損傷修復(fù)提供了新的解決方案。BMMSCs為組織工程學(xué)成骨轉(zhuǎn)化和修復(fù)骨缺損的工具細(xì)胞[9]。多方研究報道BMMSCs在軟骨損傷修復(fù)中具有明顯優(yōu)勢[9-11]。然而，單純以BMMSCs為工具的骨修復(fù)還不能達(dá)到理想目的。研究發(fā)現(xiàn)VEGF可通過細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶途徑促進(jìn)BMMSCs的增殖[12]。而另有文獻(xiàn)報道，VEGF作為旁分泌因子促進(jìn)骨折的修復(fù)、重塑過程，為骨形成或修復(fù)的正性調(diào)節(jié)因子[3-4]。這些都提示，VEGF在骨修復(fù)中可能發(fā)揮重要作用。

本研究提取分離BMMSCs，并通過轉(zhuǎn)染BMMSCs使其VEGF過表達(dá)，進(jìn)一步實驗制作誘導(dǎo)成骨膜片，建立牙槽骨損傷模型并植入膜片，觀察VEGF過表達(dá)的膜片對大鼠牙槽骨損傷修復(fù)的影響。定期進(jìn)行Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)，與空載轉(zhuǎn)染組相比，VEGF過表達(dá)的BMMSCs成骨誘導(dǎo)膜片明顯增強大鼠損傷牙槽骨的修復(fù)。提示VEGF可能通過促進(jìn)BMMSCs功能的發(fā)揮或自身的分泌增強大鼠損傷牙槽骨的修復(fù)，然而具體機制還有待于進(jìn)一步研究。本實驗還在動物實驗階段，需要臨床進(jìn)行驗證?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)VEGF過表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能增強大鼠牙槽骨損傷的修復(fù)。