鞏超彥,南芳茹,馮佳,呂俊平,劉琪,劉旭東,謝樹蓮

(山西大學 生命科學學院,山西 太原 030006)

串珠藻目Batrachospermales是淡水紅藻中最重要的代表類群,零星式分布于流動的冷泉溪中,種群多小而少。一般認為包括3科,14屬[1-3]。

psaA是植物葉綠體進行光調節(jié)的重要基因，位于葉綠體基因組的大單拷貝區(qū)[4]。它能編碼一種類囊體膜蛋白，即光系統(tǒng)Ⅰ反應中心跨膜復合物的中心蛋白A，又稱P700脫輔基蛋白A，該蛋白與psaB基因編碼的蛋白相互結合，共同作為光系統(tǒng)Ⅰ跨膜復合物的中心蛋白，承擔重要的生物學功能，構成植物光系統(tǒng)Ⅰ的中心架構。

適應是生物進化的核心,物種的演化歷程即不斷適應其生存環(huán)境的過程。在此過程中,物種的遺傳信息發(fā)生了改變,其中的一些特殊的改變經過自然選擇被固定了下來,即基因的適應性進化[5]。同時,分析基因的適應性進化還有助于我們了解基因變異和蛋白質結構與功能的改變及物種的進化史[6]。目前用于進化研究的模型有機理式模型、經驗式模型和機理-經驗式模型[7-10],而且這些模型也在應用中得到了不斷完善[11-17]。

氨基酸位點的共進化是在蛋白質內部和蛋白質間普遍存在的現(xiàn)象[18]。共進化位點的關聯(lián)特性可能源于蛋白自身結構、功能特性、編碼核苷酸構成基因組特性等。如果其中某一位點發(fā)生了適應性進化,與此相關的位點通過共進化的方式進行補償突變,這樣不僅可獲得有利于增加適應性的新性狀,同時也維持了其固有的功能[19]。識別共進化氨基酸位點對了解蛋白質氨基酸位點間可能的相互作用和蛋白適應性進化的復雜機制具有重要意義。

雖然一般認為序列高度保守是葉綠體基因組的特性之一[10],但對于起源較早、演化歷史更長的低等植物,可能會發(fā)生更多的變化。為了進一步了解串珠藻目植物的演化歷史,了解這一特殊的淡水紅藻類群究竟如何適應特殊生存環(huán)境,相關葉綠體基因是否在其演化歷程中發(fā)生了適應性進化,從而對其適應生存環(huán)境產生影響[20],本研究對其葉綠體基因psaA進行了適應性進化及共進化分析,為了解串珠藻目植物適應生存環(huán)境的分子進化機制,了解相關蛋白質內部氨基酸分子之間的相互關系及對該類群適應性進化的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

本文所用數(shù)據(jù)包括作者采集樣本測得和從GenBank收集的串珠藻目及近緣類群psaA基因42條 (表1)。其中,作者采集的7株樣本包括Batrachospermumgelatinosum(采于山西寧武縣汾河源頭,水溫11℃,生于溪流中石壁上),B.hondongense(采于山西洪洞廣勝寺泉,水溫14℃,pH 7.5,生于急流中石塊上),B.longipedicellatum(采于江蘇徐州拔劍泉,水溫16℃,pH7.5,生于石灰質巖石上),Kumanoacurvata(采于湖北當陽珍珠泉),K.intorta(采于山西臨汾龍祠泉,水溫14℃,生于泉眼邊巖石上),Sheathiaarcuata(山西太原晉祠泉,水溫12℃,pH 7,生于小溪流中巖石上)和Thoreahispida(山西平定娘子關泉,水溫15.5℃,pH 6.5,生于泉水中樹枝上)。

通過軟件Clustal X[21]分析,得到由231個密碼子組成的序列數(shù)據(jù)。

1.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構建

利用MEGA5.0分析序列特征,運行Modeltest軟件,篩選核苷酸最優(yōu)進化模型。采用最大似然法(ML)運行PhyML3.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。

1.3 適應性進化分析

利用基于psaA基因構建的ML樹,運行PAML4.8軟件包中Codeml程序中的分支模型(用于提示各分支的選擇壓力,分別運行單比率模型、自由比率模型和二比率模型并進行LRT檢驗以確定哪個模型更可靠)、位點模型(用于檢驗基因是否存在經受正選擇(ω>1)和負選擇(ω<1)的位點,分別運行M1a和M2a,M0和M3,M7和M8三對模型,前者是后者的零假設,對3對模型分別進行LRT檢驗)和分支-位點模型進行分析(用于檢驗各個指定分支中是否存在正選擇位點)。

1.4 三維結構建模

以B.gelatinosum的psaA(KM055293)序列為參考,翻譯為氨基酸序列,提交瑞士生物信息研究所(https:∥www.expasy.org/),基于同源建模原理預測其蛋白的三維結構。

1.5 共進化分析

運用基于Pearson相關系數(shù)法[22]、參數(shù)檢驗法[23]和互信息法[24]等的CAPS(Coevolution Analysis using Protein Sequences)軟件[25]分析蛋白質量部的共進化關系。

表1 種類及psaA基因的GenBank登錄號

2 結果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于選取的psaA序列,得到核苷酸最優(yōu)進化模型(表2),并基于此構建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),外類群為Galdieriamaxima和Cyanidiumcaldarium。

從圖1可以看出,內類群聚集為9個分支,包括Nothocladus屬、Nocturama屬、Sirodotia屬、Kumanoa屬、Sheathia屬、Bangia屬、Thorea屬、Batrachospermumgelatinosum和其余幾個種分別位于不同分支。

表2 psaA基因最優(yōu)進化模型參數(shù)

注:節(jié)點處的數(shù)字代表最大似然法歩靴值,A、B、C、D、E、F、G、H、I代表選定的分支。Fig.1 Phylogenetic tree established based on the psaA gene sequence圖1 基于psaA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 正選擇位點的鑒定分析

表3和表4是位點選擇的結果?？梢钥闯?分支模型中沒有正選擇位點被檢出,說明psaA基因受到強烈的負選擇。分支-位點模型中,分支CSheathia屬的186F、分支EB.gelatinosum的100A、分支HB.atropurpurea的90C*和199A、分支IThorea屬的99A、132A和179M被鑒定為正選擇位點。但是LRT檢驗均顯示上述結果不可靠。另外,分支A、B、D、F、G的備擇假設經LRT檢驗均被拒絕。

表3 模型參數(shù)估計值和對數(shù)似然值

續(xù)表3 模型參數(shù)估計值和對數(shù)似然值

2.3 psaA基因的參考三維結構

以B.gelatinosum登錄號KM055293為參考序列,對PDB數(shù)據(jù)庫進行Blast搜索模板,得到一株Thermosynechococcuselongatus(strain BP-1)的三維結構(PDB ID:4FE1)[26],相似度81.99%,一株Synechocystissp. (PCC 6803)的三維結構(PDB ID:4KT0)[27],相似度81.8%,均符合同源建模的可靠性要求?；谇罢邩嫿ǔ隽藀saA蛋白的三維結構(圖2)。但由于前者氨基酸序列同分析序列比對有缺失,因此選取后者用于后續(xù)共進化分析。

2.4 共進化位點鑒定分析

通過實驗序列和已解析的psaA蛋白質三維結構(PDB ID:4KT0)的比對確定對應氨基酸的具體位置(圖3),基于詳細的解析數(shù)據(jù)和氨基酸對的相關系數(shù)統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(20對)(表5)。序列中所有共進化氨基酸對的平均距離27.808 6 ?,標準差12.325 2?；诎被崾杷嚓P性值統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(12對)(表6)?；诎被岱肿恿肯嚓P值統(tǒng)計出的共進化組(對)5組(15對)(表7)。幾對相關系數(shù)較高的共進化位點在構建出的參考三維結構中的位置見圖4。

表4 LRT檢驗統(tǒng)計量

注:正選擇位點在圖中用白色圓圈標出Fig.2 Reference three-dimensional structure of D1 protein of Batrachospermum gelatinosum (DQ787636)圖2 Batrachospermum gelatinosum(DQ787636)D1蛋白參考三維結構

共進化組共進化對氨基酸位點1氨基酸位點2相關系數(shù)分子距離 1132350.633 49 999.000 0232820.785 29 999.000 0335820.841 49 999.000 0 2432350.633 49 999.000 05321130.659 999.000 06321640.839 79 999.000 07321760.7739 999.000 08351130.739 39 999.000 09351640.617 79 999.000 0 10351760.815 79 999.000 0 111131640.659 722.444 5121131760.860 135.901 213164170.798 618.289 5

續(xù)表5 基于氨基酸對相關系數(shù)統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

表6 基于氨基酸疏水性相關性值統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

表7 基于氨基酸分子量統(tǒng)計出的psaA蛋白的共進化組(對)

Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of psaA protein圖3 psaA蛋白質氨基酸序列對位排列

注:共進化位點在圖中用白色圓圈標出Fig.4 Spatial location of three pairs co-evolution sites圖4 3對共進化位點的空間位置

3 討論

一般認為序列高度保守是葉綠體基因組的特性之一。一個蛋白為了維持其特定的功能,其結構具有一定的保守性,因而會處于負選擇作用之下。本文對串珠藻目psaA基因的研究結果顯示,各分支均沒有檢測出有統(tǒng)計學意義的正選擇位點,可以推斷串珠藻目植物葉綠體的psaA基因處于強烈的負選擇之下,這與該基因的保守性有很大的關系。Smart等[28]發(fā)現(xiàn)psaA或psaB基因的失活都將導致PSⅠ復合物在類囊體中缺失,這表明psaA或者psaB不能單獨形成二聚體,而psaA-psaB異二聚體的存在為整個PSⅠ復合物組裝所必需,可見psaA基因編碼的PSⅠ中心蛋白A在光合作用中的重要作用。陳曉霞等[10]研究也指出,有關葉綠體基因發(fā)生適應性進化的報道尚不多見,可能的原因主要是葉綠體基因的替換率低,較少發(fā)生突變,或者葉綠體基因很少發(fā)生重復,缺乏產生新基因的來源。郁飛等[29]研究指出,高等植物、藻類和藍細菌所有已知的編碼PSⅠ結構蛋白的基因都已經被克隆,一級結構相當保守。此外,關于psaA基因的同源性研究也提示了該基因的高度保守性。Cantrell等[30]研究指出藍藻psaA基因序列同已測序的高等植物有超過95%的同源性,翻譯產物和高等植物的同基因產物也有76%～81%的一致性。這種高度的同源性提示,不僅是PSⅠ復合物的結構保守,其功能也相當保守。施定基等[31]比較了藍藻葉綠體PSⅠ的蛋白基因同若干高等植物的同源性,結果在74.60%～80.19%之間,而且物種間psaA基因的同源性與它們的進化程度相關,進化地位越相近,同源性越高。

基于氨基酸對的相關系數(shù)統(tǒng)計出的共進化組(對)之間相互關聯(lián)非常緊密,如果其中某一位點發(fā)生了適應性進化,與此相關的位點通過共進化的方式進行補償突變,以維持蛋白質特定的功能?；诎被崾杷韵嚓P性值統(tǒng)計出的共進化組(對)揭示它們的共同作用對保持蛋白質疏水性具有重要作用?；诎被岱肿恿肯嚓P性值統(tǒng)計出的共進化組(對)則提示它們同蛋白質分子量大小顯著相關。本文分析得到若干對串珠藻目植物psaA基因內部不同位置的共進化組(對),從另一個角度分析了蛋白質內部氨基酸之間的相互關系,有助于研究蛋白質的功能結構特征及其進化歷程,為研究有關蛋白結構功能和進化提供了優(yōu)先考慮的位點。

隨著分子生物學的發(fā)展,psaA基因作為標志分子在藻類植物分類系統(tǒng)發(fā)育研究中的應用也值得關注。一般來說,葉綠體基因組具有基因組較小、在進化過程中很少發(fā)生重排、進化速率保守、包含大量的DNA成分可提供足夠數(shù)量的系統(tǒng)發(fā)育信息、編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列進化速率相差較大等特征[32-33],因此,非常適用于不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育分析研究。一般認為,功能蛋白編碼基因受其功能限制,進化速率慢,適于屬間及以上分類單元群體的關系研究,而非編碼區(qū)基因不參與蛋白質的合成,進化速率相對較快,多樣性較高,適合于種內及種間的群體關系研究[34-35]。本研究結果顯示,psaA基因在串珠藻目中是很保守的,是屬及以上分類單元群體的系統(tǒng)發(fā)育關系研究的重要分子標記。

生物體演化的歷程和分子機制是極其復雜的,因此,要解釋清楚為何淡水紅藻分布區(qū)狹窄、對生境的要求很特殊,需要繼續(xù)對更多的基因展開深入研究,進一步深化對葉綠體基因為適應環(huán)境而發(fā)生的分子水平的適應性進化機制的認識。