汪雪睿，唐金蕾，李 政，程 代，王春玲

(天津科技大學新農(nóng)村發(fā)展研究院，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

高血壓是一種常見的心血管綜合癥.每年全世界因高血壓病及其繼發(fā)于高血壓的心力衰竭、腦梗塞與腦出血、腎功能衰竭等引發(fā)的死亡人數(shù)約有730萬[1-2].由于腎臟在人體中有著維持血容量和電解質(zhì)平衡以及調(diào)節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的重要作用，因此也是高血壓損害的主要靶器官之一.高血壓最終會導致腎功能不全及其他重要臟器損傷[3-4]，甚至引發(fā)腎功能衰竭而死亡[5].高血壓導致腎臟損傷的啟動因素是由于持續(xù)升高的血壓水平會導致腎臟血流動力學紊亂，具有促氧化和促炎作用.

蕎麥營養(yǎng)價值十分豐富，我國蕎麥品種可達10余種，包括甜蕎、苦蕎麥、小野蕎麥、金蕎麥、線葉野蕎麥等[6].蕎麥中富含多種天然抗氧化劑，如兒茶酸、蘆丁、槲皮素、蕎麥蛋白等，具有清除人體內(nèi)的氧化自由基、提高抗氧化酶活性并降低脂質(zhì)過氧化物的功效[7].楊體模等[8]的研究表明，金蕎麥的有效部位還具有抑制腫瘤生長的作用.蕎麥中含有的蘆丁等黃酮類物質(zhì)、D-手性肌醇及其衍生物、γ-氨基丁酸和其他由蕎麥蛋白酶解后的多肽類等具有降低血壓的作用[8-11].蕎麥降血壓肽可通過抑制血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶的活性，起到調(diào)節(jié)血壓的作用[12-15].因此，蕎麥是一類營養(yǎng)豐富并具有保健作用的糧食作物，有很大的開發(fā)利用價值.

近年來，預防氧化應激對血管內(nèi)皮細胞以及腎、腦等器官造成的氧化損傷成為治療高血壓的新研究方向.蕎麥既具有降低血壓的功效還富含多種天然的抗氧化物質(zhì)，而日常膳食中增加蕎麥對高血壓造成的氧化應激是否有療效值得進一步研究.因此，本文旨在研究蕎麥粉飲食干預對高血壓大鼠腎臟損傷的保護作用.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與蕎麥

實驗動物為5～7 周齡雄性 Wistar 大鼠(SPF級)，體質(zhì)量 80～100 g，共110 只.實驗動物和普通飼料均由中國人民解放軍事醫(yī)學科院實驗動物中心提供(許可證號：SCXK-(軍)2012-0004).實驗所用9 種蕎麥品種、產(chǎn)地和育種單位見表1.

表1 商品蕎麥的來源Tab.1 The source of buckwheat

1.1.2 試劑與儀器

磷酸緩沖鹽(pH 7.2)，分析純，北京索來寶科技有限公司；異丙醇，分析純，天津北方天醫(yī)化學試劑廠；SDS，美國Sigma-Aldrich 公司；食鹽，食品級，天津市長蘆鹽業(yè)有限公司；液氮，東祥特種氣體有限公司.

BP-2010AE 型鼠尾動脈無創(chuàng)血壓儀，北京軟隆科技有限公司；高速冷凍離心機，美國Beckman 公司；超低溫冰箱、MK-3 型酶標儀，美國Termo 公司；TG328A 型分析天平、YP 型電子天平，上海天平儀器廠；DYY-Ⅲ12B 型三恒多用電泳儀，美國Bio-Rad Laboratories 公司.

1.2 方法

1.2.1 造模方法

將110 只雄性Wistar 大鼠隨機平均分為11 組，分別為空白對照組(普通飼料，0.5% NaCl)、模型組(8% NaCl 飼料)和9 組雜糧實驗組(8% NaCl+15%蕎麥).9 組雜糧實驗組分別添加的是六苦3 號、信農(nóng)1 號、川蕎2 號、泰興蕎麥2013、川蕎1 號、西農(nóng)9976、西農(nóng)9940、赤甜蕎1 號、寧蕎1 號，編號為實驗組1#—實驗組9#.在適應性喂養(yǎng)(0.5% NaCl 顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水)1 周后，開始高鹽模型的建立，共飼養(yǎng)8 周.自由飲水和攝食，蕎麥粉為蕎麥全粉.

1.2.2 血壓測量

適應性飼養(yǎng)1 周后開始測量尾動脈血壓，每周測量1 次.測量時使室溫保持 22～25 ℃，將大鼠移至血壓測量室，適應 30 min 左右，待尾動脈血壓測量.將BP-2010AE 型無創(chuàng)尾動脈血壓測量分析系統(tǒng)和計算機連接好，將大鼠裝入與其體型大小相符的鼠袋并將大鼠尾穿過尾固定器孔，使加壓氣囊套在尾部近心端處，固定好鼠尾，即可開始測定.打開機器，記錄系統(tǒng)會逐漸出現(xiàn)脈搏信號，當出現(xiàn)正弦曲線的脈搏圖形后，進行注氣加壓測量尾動脈.每只大鼠測量3次，間隔30 s 左右，最后取其平均值作為大鼠的尾動脈血壓.

飼料添加蕎麥對血壓升高的抑制效果用抑制血壓升高指數(shù)表示，抑制血壓升高指數(shù)按照式(1)計算.當指數(shù)小于1，則對血壓升高有抑制效果；當大于1，則對血壓升高無抑制效果.指數(shù)越小，蕎麥抑制血壓升高效果越好.

式中：p空白、p模型和p實驗分別表示空白組、模型組和實驗組大鼠的收縮壓，單位為mmHg.

1.2.3 腎臟取材及材料預處理

飼養(yǎng)7 周結(jié)束后對大鼠進行稱量.采用股動脈放血法處死大鼠，然后解剖大鼠切取腎臟，放入冰敷生理鹽水中剝?nèi)ケ荒?取出腎臟用濾紙吸去表面水分并稱量兩側(cè)腎臟總質(zhì)量，大鼠腎臟指數(shù)按照式(2)計算.腎臟組織用錫箔紙包裹，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃低溫冰箱保存，用于后續(xù)實驗數(shù)據(jù)的測定.

1.2.4 羥脯氨酸(Hyp)含量的測定

羥脯氨酸是機體膠原蛋白的主要組成成分之一，組織中Hyp 的含量可以衡量其膠原代謝情況，判斷組織的纖維化程度[16].羥脯氨酸的測定采用堿水解法：Hyp 在氧化劑的作用下所產(chǎn)生氧化物與二甲氨基苯甲酸反應呈現(xiàn)紫紅色，在550 nm 波長下有強吸收.顯色反應用組織Hyp 檢測試劑盒(南京建成試劑有限公司)，反應后取150 μL 反應液至96 孔板，于550 nm 處測定各孔吸光度(A).腎組織中Hyp 含量(μg/g)按式(3)計算.

式中：標準品含量為 5 μg/mL，水解液總體積為10 mL，組織濕質(zhì)量為0.05 g.

1.2.5 腎組織蛋白定量表達測定

MAPK 信號通路是存在于真核細胞中的一種信號轉(zhuǎn)導途徑，利用一系列蛋白激酶進行細胞膜到細胞核之間的信號轉(zhuǎn)導.該通路能夠調(diào)節(jié)細胞生長、分化等多種生物學功能.為了驗證六苦3 號蕎麥和信農(nóng)1號蕎麥抑制高鹽誘導型高血壓大鼠腎組織纖維化的功效是否與MAPK 信號通路的介導有關，采用免疫印跡(Western blot)方法測定大鼠腎組織Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平的變化.

腎組織蛋白提?。喝?00 mg 樣品放入EP 管，加蛋白提取液(Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L PMSF)并冰上研磨，靜置20 min.4 ℃、12 000 r/min 離心10 min.取上清液，加入上樣緩沖液混勻煮沸10 min，緩慢恢復至室溫后于-20 ℃保存.

免疫印跡：采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離目標蛋白.含12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量 30 g，蛋白濃縮電壓 80 V，分離電壓120 V.電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜電流300 mA.然后將轉(zhuǎn)移膜用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h.轉(zhuǎn)移膜經(jīng)PBST 洗膜后加入一抗和二抗進行免疫雜交，并用PBST 洗去未結(jié)合的殘余抗體.特異性雜交條帶用化學發(fā)光液處理并經(jīng)顯影定影后，用柯達膠片感光成像檢測.

1.2.6 統(tǒng)計學處理

用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”來表示.組間比較采用方差分析，*表示與空白組相比有顯著差異(P＜0.05)，#表示與模型組相比有顯著差異(P＜0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 蕎麥對大鼠尾動脈收縮壓的影響

實驗前各組間大鼠血壓基本一致(P＞0.05)，各組大鼠尾動脈收縮壓值隨飼養(yǎng)時間的變化見表2.

表2 大鼠尾動脈收縮壓隨飼養(yǎng)時間的變化情況(n=10)Tab.2 SBP of rat with the change of time(n=10)

喂養(yǎng)結(jié)束后，空白組整體收縮壓保持平穩(wěn)；模型 組大鼠尾動脈收縮壓與空白組相比升高了26.5%(P＜0.05)，表明高鹽(8%)誘導高血壓大鼠模型建立成功；與模型組第7 周收縮壓值相比，實驗組均有所降低，說明15%的蕎麥飲食干預可以抑制高鹽導致血壓的升高.該結(jié)論與張宏偉等[17]的研究結(jié)果相一致.此外，9 種蕎麥的預防效果差異較大：六苦3 號和信農(nóng)1 號分別降低10.1%和9.7%(P＜0.05)，川蕎2 號、泰興蕎麥2013、川蕎1 號、西農(nóng)9976、西農(nóng)9940、赤甜蕎1 號和寧蕎1 號分別降低5.3%、4.8%、5.0%、3.2%、1.0%、2.5%和3.4%(P＞0.05).9 種蕎麥抑制血壓升高指數(shù)(表3)表明，對高鹽誘導型高血壓預防效果最好的是六苦3 號和信農(nóng)1 號.

表3 各蕎麥抑制血壓升高指數(shù)(n=10)Tab.3 Index of buckwheat to inhibit blood pressure increase(n=10)

2.2 大鼠腎臟指數(shù)

蕎麥干預高鹽飲食大鼠7 周后，腎臟指數(shù)見表4.模型組比空白組高37.1%(P＜0.05)，即8%的高鹽飼料能夠?qū)е麓笫竽I臟質(zhì)量增加.實驗組大鼠的腎臟質(zhì)量與模型組相比，六苦3 號、信農(nóng)1 號、川蕎2 號、泰興蕎麥2013、西農(nóng)9976、西農(nóng)9940、赤甜蕎1 號分別降低17.6%、15.3%、12.9%、8.2%、10.6%、9.4%和10.6%(P＜0.05)，表明15%蕎麥攝入可以抑制高鹽誘導型高血壓大鼠腎臟指數(shù)升高.然而，川蕎1 號和寧蕎1 號對高血壓大鼠腎臟指數(shù)的升高無明顯抑制作用(P＞0.05).

表4 蕎麥干預高鹽飲食7周后各組大鼠腎臟指數(shù)(n=10)Tab.4 Index of rat kidney after buckwheat intervention in high-salt diet for 7 weeks(n=10)

長期的高鹽(8%)飲食會導致Wistar 大鼠血壓顯著升高，最終表現(xiàn)為高血壓癥狀，而15%蕎麥攝入對于高鹽誘導的大鼠血壓升高具有顯著的預防效果.在本研究中，9 種蕎麥的預防效果各有差異，從而為不同品種蕎麥預防高血壓提供了品質(zhì)級別參考.此外，抑制血壓升高指數(shù)和腎臟指數(shù)兩項指標顯示，預防效果最好的是六苦3 號蕎麥和信農(nóng)1 號蕎麥.因此，在后續(xù)實驗中重點選擇這兩種蕎麥飼喂的大鼠進行深入研究.

2.3 腎組織Hyp含量

通過測定腎組織中Hyp 的含量可以衡量腎組織的纖維化程度.大鼠腎組織Hyp 含量測定結(jié)果如圖1 所示.

圖1 大鼠腎組織Hyp含量Fig.1 Concentration of Hyp in rat

空白對照組、模型組、六苦3 號和信農(nóng)1 號實驗組大 鼠 腎 組 織 Hyp 含量分別為 364.69 μg/g、436.02 μg/g、377.39 μg/g 和378.71 μg/g；模型組比空白對照組大鼠腎組織Hyp 含量高19.6%(P＜0.05)，表明8%的高鹽攝入能夠?qū)е麓笫竽I組織Hyp 含量升高，導致腎組織纖維化程度加??；六苦3 號和信農(nóng)1 號實驗組大鼠腎組織Hyp 含量比模型組分別降低13.4%和13.1%(P＜0.05)，即15%六苦3 號蕎麥和15%信農(nóng)1 號蕎麥攝入可以抑制高鹽誘導的高血壓大鼠腎組織Hyp 含量的升高.

腎臟的纖維化會破壞腎單位，最終出現(xiàn)慢性腎功能衰竭，導致腎臟排鈉排水功能降低，鈉水潴留，繼而引起血容量和心輸出量增多，導致鈉依賴性高血壓.研究結(jié)果表明，15%六苦3 號蕎麥和15%信農(nóng)1號蕎麥攝入可以顯著抑制大鼠腎組織Hyp 含量的升高.實驗從腎組織纖維化程度這一角度表明：蕎麥通過抑制腎組織Hyp 含量的升高緩解腎組織的纖維化進程，進而抑制了高鹽誘導的血壓升高.

2.4 MAPK細胞信號通路相關蛋白表達水平

Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平分別如圖2—圖4所示.與空白對照組大鼠相比，模型組大鼠腎組織Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平分別提高了32.2%、27.5%和40.7%，差異具有顯著性(P＜0.05)，說明8%的高鹽攝入能夠?qū)е麓笫竽I組織Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平的升高.

圖2 蕎麥對大鼠腎組織Src蛋白表達的影響Fig.2 Effect of buckwheat on the expression of Src protein in rat kidney

圖3 蕎麥對大鼠腎組織Ras蛋白表達的影響Fig.3 Effect of buckwheat on the expression of Ras protein in rat kidney

與模型組大鼠相比，六苦3 號組大鼠腎組織Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平分別降低了20.1%、17%和25.9%，差異具有顯著性(P＜0.05)；信農(nóng)1 號組大鼠腎組織Src、Ras 和Raf 蛋白表達水平分別降低了22.4%、16.3%和24.7%，差異具有顯著性(P＜0.05).這說明15%六苦3 號蕎麥和15%信農(nóng)1 號蕎麥攝入可以抑制高血壓大鼠腎組織Src、Ras 和Raf蛋白表達水平的升高.可有效減少因Src 蛋白誘導轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)的產(chǎn)生，減緩高血壓的發(fā)生過程[18]；減少由Ras、Raf 蛋白導致的MEK1/2 磷酸化[19].

圖4 蕎麥對大鼠腎組織Raf蛋白表達的影響Fig.4 Effect of buckwheat on the expression of Raf protein in rat kidney

3 結(jié) 論

長期攝入高鹽食物會導致Wistar 大鼠血壓顯著性升高，最終誘導高血壓.而攝入含15%蕎麥的飲食可預防高鹽所導致的大鼠血壓升高.不同的蕎麥品種預防效果不同，六苦3 號＞信農(nóng)1 號＞川蕎2 號＞川蕎1 號＞泰興蕎麥2013＞寧蕎1 號＞西農(nóng)9976＞赤甜蕎1 號＞西農(nóng)9940，其中六苦3 號和信農(nóng)1 號蕎麥的預防效果最佳.六苦3 號和信農(nóng)1 號蕎麥可顯著抑制高血壓導致的腎組織Hyp 含量的升高；六苦3號蕎麥和信農(nóng)1 號蕎麥能抑制MAPK 信號通路相關蛋白的表達，從而起到抑制高鹽誘導型高血壓大鼠腎組織纖維化.