朱麗君，王魯霞，武 玲，趙寶義，范美霞，姜祎頔

(1.菏澤市行政審批服務(wù)局，山東 菏澤 274000; 2.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000)

二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)是深海魚油中的特征脂肪酸，屬Ω-3多不飽和脂肪酸，是人體重要的營養(yǎng)成分?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA不僅具有抑制血小板凝聚、舒張血管、調(diào)節(jié)血脂、健腦明目、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)嬰兒視網(wǎng)膜發(fā)育等功能，可以防治心腦血管疾病、炎癥、腎病等[1-4]，而且其具有通過抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和侵襲[5]從而防治癌癥的功效，因此魚油產(chǎn)品為專家所推崇。目前，高品質(zhì)或經(jīng)深加工的魚油主要用于食品、保健品以及藥品[6]，其中以保健品最多。當(dāng)前市場上魚油保健品質(zhì)量參差不齊[7]，普通魚油類產(chǎn)品中EPA和DHA的含量遠(yuǎn)遜于深海魚油類產(chǎn)品[8]，容易誤導(dǎo)消費(fèi)者。因此，檢測魚油保健品中EPA和DHA的含量成為辨別其質(zhì)量的重要方法。針對國標(biāo)GB 5009.168—2016中試樣前處理方法中靜置分離較慢及程序升溫時間較長的問題，本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，在保證分離度的前提下，對前處理和程序升溫方法進(jìn)行優(yōu)化，同時進(jìn)行了方法驗證，依據(jù)優(yōu)化方法對市場上10個廠家生產(chǎn)的不同批次魚油保健品進(jìn)行EPA和DHA含量的測定，為魚油保健品的辨別提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯、十一烷酸甲酯和十一烷酸甘油三酯對照品，購自上海安譜實驗科技股份有限公司，批號分別為US170803-21、P0470020、Q3890020和K1850200，含量均大于等于99%；甲醇、正庚烷、異辛烷為色譜純；其余試劑均為分析純；水為一級水；魚油保健品，來自10個不同廠家。

安捷倫7890B氣相色譜儀，梅特勒XS-105微量分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對照品溶液的制備

將二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯對照品分別用正庚烷配制成質(zhì)量濃度為0.695、0.557 mg/mL和0.974 5 mg/mL的對照品儲備液，貯存于-10℃以下冰箱。將十一烷酸甘油三酯對照品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為4.028 4 mg/mL 的對照品儲備液，在冰箱中冷藏。

1.2.1.2 供試品溶液的制備(酯交換法)

稱取均勻試樣60.0 mg至具塞試管中，精確至0.1 mg。準(zhǔn)確加入2.0 mL質(zhì)量濃度為4.028 4 mg/mL的十一烷酸甘油三酯內(nèi)標(biāo)溶液。加入4 mL異辛烷，微熱使試樣溶解后加入200 μL氫氧化鉀甲醇溶液，蓋上玻璃塞猛烈振搖30 s后靜置至澄清。加入1 g硫酸氫鈉，猛烈振搖，中和氫氧化鉀。離心[11]，取上清液移至上機(jī)瓶中，待測。

1.2.2 色譜條件的選擇及測定

色譜條件：采用安捷倫HP-88色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，進(jìn)樣口溫度270℃，F(xiàn)ID溫度280℃，載氣為氮?dú)?，柱流? mL/min，以程序升溫速率及不同分流比篩選，要求得到的色譜條件應(yīng)滿足理論塔板數(shù)(n)至少2 000/m，分離度(R)至少1.25。

測定方法：分別精密吸取對照品系列使用液與供試品溶液1.0 μL，注入氣相色譜儀測定。以保留時間定性，以色譜峰峰面積定量。

1.2.3 線性關(guān)系考察

將二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯對照品儲備液分別用正庚烷稀釋制備系列使用液，二十碳五烯酸甲酯和二十二碳六烯酸甲酯對應(yīng)質(zhì)量濃度分別為5.57、11.14、27.85、55.70、278.50 μg/mL和6.95、13.90、34.75、69.50、347.50 μg/mL，十一烷酸甲酯質(zhì)量濃度均為97.45 μg/mL，混勻后備用。精密吸取各使用液1.0 μL，注入氣相色譜儀測定。

1.2.4 精密度實驗

精密吸取二十二碳六烯酸甲酯、二十碳五烯酸甲酯和十一烷酸甲酯質(zhì)量濃度分別為55.70、69.50 μg/mL和97.45 μg/mL的對照品使用液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次1.0 μL，記錄目標(biāo)物峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積，計算響應(yīng)因子(Fi)。

1.2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗

取同一批樣品6份，按1.2.1.2方法處理。進(jìn)樣量1.0 μL，計算EPA和DHA的含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)；取同一批樣品分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，計算EPA和DHA的含量及RSD。

1.2.6 加標(biāo)回收實驗

準(zhǔn)確稱取同一批樣品9份，分別加入對照品使用液，每個水平3份，按1.2.1.2方法處理。分別進(jìn)樣1.0 μL，計算EPA和DHA的含量和回收率。

1.2.7 樣品含量測定

以建立的方法測定10個不同廠家魚油保健品，按內(nèi)標(biāo)法計算EPA和DHA的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法的優(yōu)化

GB 5009.168—2016未提出均勻取樣的具體要求，由于實驗需要稱取的樣品質(zhì)量較少，一般取1～2粒軟膠囊即能滿足要求。樣品膠囊間的個體差異會導(dǎo)致測定含量的不同。針對這個問題，本文采用取20粒膠囊混勻后再準(zhǔn)確稱量的方法，經(jīng)實驗驗證，所得結(jié)果精密度較高[12]。

供試品溶液的制備過程中，后期靜置分離過程較慢，并隨靜置時間不同分離效果不同，本文改為5 000 r/min離心7 min，分離效果較好，上清液較靜置效果更清澈，取樣測定，結(jié)果更精準(zhǔn)，并有效去除了部分雜質(zhì)，減少了雜峰數(shù)量。對照品和樣品圖譜分別見圖1和圖2。

圖1 EPA甲酯和DHA甲酯對照品圖譜

圖2 樣品圖譜

2.2 色譜條件的優(yōu)化

國標(biāo)GB 5009.168—2016中的程序升溫方法針對37種脂肪酸的測定，出峰時間較長。本文分流比優(yōu)化為20∶ 1。將程序升溫條件優(yōu)化為：100℃保持3 min，以10℃/min的速率升溫至200℃，保持20 min，再以4℃/min的速率升溫至240℃，保持10.5 min。優(yōu)化后樣品圖譜見圖3。由圖2和圖3對比可知，EPA和DHA樣品峰保留時間分別提前了約21 min和28 min，而其分離度分別為6.13和5.07，符合國標(biāo)中分離度至少1.25的要求。

圖3 優(yōu)化條件后樣品圖譜

2.3 線性關(guān)系考察

取系列對照品使用液各1.0 μL，注入氣相色譜儀，記錄目標(biāo)物峰面積(Ai)及內(nèi)標(biāo)峰面積(A11)，計算Y=Ai/A11和X=ρi/ρ11，根據(jù)Y與X繪制線性回歸曲線，計算平均響應(yīng)因子Fi=X/Y，結(jié)果見表1。由表1可知，EPA和DHA分別在5.57～278.50 μg/mL 和6.97～248.50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

表1 EPA和DHA線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度實驗

測得目標(biāo)物峰面積及內(nèi)標(biāo)峰面積，計算EPA和DHA平均響應(yīng)因子分別為0.883 5和1.682 6，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.43%和1.05%，表明本方法精密度良好[13-14]。

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性實驗

按1.2.1.2方法處理樣品，平行處理6份，計算EPA和DHA的含量，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.04%和1.62%，說明色譜系統(tǒng)重復(fù)性良好。取同一批次樣品分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣分析，計算EPA和DHA的含量，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.48%和1.27%，說明供試品溶液穩(wěn)定性良好[13-14]。

2.6 加標(biāo)回收實驗

EPA和DHA加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表2。

表2 EPA和DHA加標(biāo)回收實驗結(jié)果

由表2可知，EPA和DHA加標(biāo)樣品平均回收率分別為100.47%和101.43%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.03%和1.19%，均小于2%，符合含量測定的準(zhǔn)確性要求[13-14]。

2.7 樣品含量測定

對市售的魚油保健品進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品中EPA和DHA的測定含量與標(biāo)示含量對比 g/100 g

由表3可知，市售的10種魚油保健品中，EPA和DHA的含量高低不等，其與標(biāo)簽標(biāo)示值相比也有高有低，其中不乏以次充好的產(chǎn)品(如樣品9)。而魚油中EPA和DHA的配比不同，對人體產(chǎn)生的保健作用也不盡相同[15]。因此，如何購買到質(zhì)量好又適合自己的魚油保健品，需要有效的測定方法提供科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

本文以GB 5009.168—2016為依據(jù)，對國標(biāo)方法中的樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過線性關(guān)系考察、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性、加標(biāo)回收等方式對已建立的方法進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明：EPA和DHA分別在5.57～278.50 μg/mL和6.97～348.50 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性良好。利用已建立的檢測方法對市售10個廠家生產(chǎn)的不同批次魚油保健品進(jìn)行EPA和DHA的含量測定，揭示了市場上魚油保健品質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)狀，為魚油保健品質(zhì)量規(guī)范的建立提供一定的科學(xué)依據(jù)。