徐 玥，張存勞，楊 耿，劉 凱，馮鎖民

(1.西安醫(yī)學院 藥學院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設計院有限公司，西安 710082)

牡丹籽油是油用牡丹籽經(jīng)加工得到的植物油，已被國家批準為新資源食品，其不飽和脂肪酸含量為82.81%～93.23%，明顯高于其他普通食用植物油[1-3]。陜西油用牡丹種植面積已達4萬hm2，全國排名第二，且種植面積還在逐年擴大。然而作為牡丹籽油生產的副產物牡丹籽餅，目前主要作為飼料、肥料或者廢棄，造成資源浪費[4]。牡丹籽餅中富含油脂、多糖、蛋白質、多酚類等多種成分[5]，針對餅中油脂[6]、多糖[7]的綜合利用開發(fā)已有文獻報道，研究結果為油用牡丹資源產業(yè)鏈延伸提供了依據(jù)。但牡丹籽餅中蛋白質研究報道較少，牡丹籽餅中蛋白質含量達26.98%[6]，可作為天然植物蛋白來源，也可作為生物活性肽的良好來源。目前蛋白質的常用提取方法有堿提酸沉法、水提法、鹽析法等，其中堿提酸沉法工業(yè)化生產應用較多。因此，本研究以牡丹籽餅為原料，采用堿提酸沉法結合單因素試驗和正交試驗優(yōu)化蛋白質提取工藝條件，以期為牡丹籽蛋白綜合利用和功能性研究提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽餅，陜西產牡丹籽不脫殼經(jīng)熱壓榨獲得；石油醚(60～90℃)、磷酸、95%乙醇、氫氧化鈉，均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G250，天津市科密歐化學試劑有限公司；牛血清球蛋白V(純度≥98%，批號B21882)，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸，分析純，四川隴西化工有限公司。

1.1.2 儀器與設備

BT125型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；DZKW型電熱恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器廠；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；TD5M型低速大容量離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；Cary60型紫外分光光度儀，Agilent Technologies UV-Vis。

1.2 試驗方法

1.2.1 牡丹籽餅脫脂處理[8]

牡丹籽餅粉碎后，過60目篩，低溫干燥，以石油醚為溶劑，采用索氏提取法脫脂，備用。經(jīng)凱氏定氮法測定，其蛋白質含量為21.1%。

1.2.2 牡丹籽蛋白的提取

脫脂牡丹籽粉→加一定pH的堿液→恒溫振蕩提取→離心(3 500 r/min，10 min)→上清液(蛋白提取液)調pH→離心→沉淀水洗至中性→牡丹籽蛋白。

1.2.3 牡丹籽蛋白提取率的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

采用考馬斯亮藍法。精密稱取考馬斯亮藍G250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇，再加85%磷酸溶液100 mL，蒸餾水稀釋定容至1 000 mL，備用。精密稱取牛血清球蛋白V 0.005 50 g，加蒸餾水定容至25 mL，并稀釋成系列質量濃度(22、44、66、88、110、132、152 μg/mL)的標準工作液，備用。分別取不同質量濃度的標準工作液1 mL，再分別加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，放置5 min，于595 nm下測定吸光度(A)。以牛血清球蛋白V質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線，擬合得回歸方程。

1.2.3.2 牡丹籽蛋白提取液中蛋白質含量的測定

精密移取牡丹籽蛋白提取液1 mL，加入5.0 mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，放置5 min，于595 nm下測定吸光度。代入標準曲線回歸方程，得到牡丹籽蛋白提取液中蛋白質含量。

1.2.3.3 蛋白提取率的計算

蛋白提取率=蛋白提取液體積×蛋白提取液中蛋白質含量/(原料質量×原料中蛋白質含量)×100%

1.2.4 牡丹籽蛋白酸沉pH的確定

取牡丹籽蛋白提取液，在25℃下分別將其pH調至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，靜置1 h后離心(3 500 r/min，10 min)，沉淀水洗至中性，真空干燥至恒重。由下式計算蛋白沉淀率，進而確定酸沉pH。

沉淀率=沉淀質量/(蛋白提取液質量×提取液中蛋白質含量)×100%

2 結果與分析

2.1 蛋白標準曲線的回歸方程

按照1.2.3.1繪制標準曲線，擬合得回歸方程A=6.663 9C+0.022(r=0.999 5)，牛血清球蛋白V質量濃度在22～152 μg/mL范圍內線性關系良好。方法學考察表明：精密度RSD為0.80%(n=6)；6 h內顯色穩(wěn)定性RSD為1.65%(n=6)；重復性RSD為2.0%(n=6)；平均加標回收率為95.28%、RSD為2.82%(n=9)。說明該方法可以用作蛋白質含量的測定。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對牡丹籽蛋白提取率的影響

在提取溫度40℃、提取時間60 min、堿液pH 8.0條件下，考察料液比(1∶ 4、1∶ 6、1∶ 8、1∶ 10、1∶ 12)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖1。由圖1可知，牡丹籽蛋白提取率隨料液比增加呈先增大后減小的趨勢。

圖1 料液比對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.2.2 提取溫度對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取時間60 min、堿液pH 8.0條件下，考察提取溫度(45、50、55、60、65℃)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取溫度對牡丹籽蛋白提取率的影響

由圖2可知，牡丹籽蛋白提取率隨提取溫度升高呈先增大后減小的趨勢。隨著提取溫度的升高，蛋白質溶解增加和水分子運動的加劇促進了蛋白質的溶出。當提取溫度超過50℃時，提取率降低，其原因可能是溫度過高破壞了蛋白質的結構，導致部分蛋白質變性[9]。

2.2.3 提取時間對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取溫度55℃、堿液pH 8.0條件下，考察提取時間(40、60、80、100、120 min)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖3。由圖3可知，牡丹籽蛋白提取率隨提取時間延長呈先增大后減小的趨勢，當提取時間達60 min時，提取率達最大值。

圖3 提取時間對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.2.4 堿液pH對牡丹籽蛋白提取率的影響

在料液比1∶ 8、提取溫度55℃、提取時間60 min條件下，考察堿液pH(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5)對牡丹籽蛋白提取率的影響，結果見圖4。由圖4可知，牡丹籽蛋白提取率隨堿液pH增加呈先增大后減小的趨勢，當pH大于8.0時提取率呈下降趨勢，可能是由于強堿環(huán)境破壞了蛋白質結構[10]。

圖4 堿液pH對牡丹籽蛋白提取率的影響

2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果進行正交試驗設計，選擇料液比(A)、堿液pH(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)為考察因素，各取3個水平，利用L9(34)正交表設計正交試驗。 正交試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，4個因素對牡丹籽蛋白提取率的影響順序依次為A>D>B>C(料液比>提取時間>堿液pH>提取溫度)。最優(yōu)水平組合為A3B2C1D3，綜合考慮2.2.3項試驗結果和節(jié)能減耗，最終確定最佳提取工藝條件為A3B2C1D2，即料液比1∶ 12、堿液pH 8.5、提取溫度45℃、提取時間60 min。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗結果

2.4 驗證試驗

根據(jù)正交試驗得到的最佳提取工藝參數(shù)，進行3次平行驗證試驗，測得牡丹籽蛋白提取率依次為78.19%、78.22%、78.28%，平均值為(78.23±0.04)%。

2.5 牡丹籽蛋白酸沉pH

取最佳工藝條件下獲得的牡丹籽蛋白提取液，按1.2.4操作，不同pH對應的蛋白沉淀率如圖5所示。由圖5可知，隨著pH增大蛋白沉淀率呈先增大后減小趨勢。當pH為4.0時蛋白沉淀率最大，達(90.90±0.11)%。因此，選擇牡丹籽蛋白酸沉條件為pH 4.0。

圖5 酸沉條件對蛋白沉淀率的影響

3 結 論

在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優(yōu)化牡丹籽餅中蛋白質的堿提酸沉提取工藝條件。確定最佳工藝條件為：料液比1∶ 12，堿液pH 8.5，提取時間60 min，提取溫度45℃。在最佳工藝條件下牡丹籽蛋白提取率為(78.23±0.04)%；牡丹籽蛋白最佳酸沉條件為pH 4.0，此時蛋白沉淀率達(90.90±0.11)%。