丁澤敏,吳俊鋒，劉文婷，曾朝喜，郭時(shí)印

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省菜籽油營(yíng)養(yǎng)健康與深度開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 410128)

油茶蒲是油茶果的最外層，含有茶皂素、木質(zhì)素等成分，是化學(xué)工業(yè)、輕工業(yè)等的原料，能夠用來(lái)制作活性炭等產(chǎn)品[1]。在油茶果加工過(guò)程中，油茶蒲常被當(dāng)成廢棄物焚燒，開(kāi)發(fā)和利用的比例非常低。我國(guó)每年有百萬(wàn)噸油茶蒲，合理開(kāi)發(fā)利用這種副產(chǎn)物有很大的意義[2]。在國(guó)內(nèi)外油茶蒲利用和研究方面的重點(diǎn)常放在茶皂素提取和活性炭制備上，但隨著研究的深入，油茶蒲中含量豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)日益受到關(guān)注。

植物多酚(Plant polyphenol)是主要存留于水果、谷類(lèi)、豆類(lèi)、茶等植物內(nèi)的復(fù)雜酚類(lèi)構(gòu)造的化合物，多位于葉片、果殼、果肉中[3]。植物多酚按結(jié)構(gòu)可以分成酚酸類(lèi)、類(lèi)黃酮類(lèi)和1,2-二苯乙烯及木酚素類(lèi)[4]。由于多酚結(jié)構(gòu)的特殊性，使其擁有很好的抗氧化和清除自由基的作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)植物多酚在預(yù)防生理機(jī)能退化，降低血液中的葡萄糖含量，防御和治療循環(huán)系統(tǒng)疾病，清除人體的游離基等方面都具有驚人的效果，因此有“第7營(yíng)養(yǎng)素”的美譽(yù)[5]。在植物多酚的研究中，分離提取是其中關(guān)鍵的一環(huán)。將酸性甲、乙醇或者丙酮和水用于多酚的水浴加熱浸提的方法比較常見(jiàn)[6]。但是傳統(tǒng)方法不僅在環(huán)保性和安全性上存在缺陷，同時(shí)還存在不能滿(mǎn)足同時(shí)快速萃取不同極性產(chǎn)物和保持產(chǎn)物活性的問(wèn)題。

2004年，Abbott等[7]首次提出了低共熔溶劑(Deep eutectic solvents)的概念，并在之后將其應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。低共熔溶劑是一種由氫鍵供體和氫鍵受體組成的低熔混合物[8]，由于其組分的安全性和生物可降解性，被認(rèn)為是一種綠色溶劑。2011年由Choi實(shí)驗(yàn)室提出的一種新型溶劑概念——天然低共熔溶劑(Natural deep eutectic solvent)，這是一種全部使用葡萄糖、蔗糖等糖類(lèi)，強(qiáng)有機(jī)堿及其衍生物，尿素等小分子生物代謝產(chǎn)物作為成分構(gòu)成的低共熔溶劑[9]，被認(rèn)為是新一代的設(shè)計(jì)溶劑，用于天然產(chǎn)物提取，具有綠色、高效、提取的產(chǎn)物極性范圍廣和保持產(chǎn)物高活性等優(yōu)勢(shì)[10]。目前天然低共熔溶劑用于生物活性物質(zhì)的提取剛剛起步，對(duì)于其提取機(jī)制還不清楚。

Wei等[11]將天然低共熔溶劑用于木豆葉中酚類(lèi)物質(zhì)的提取，結(jié)果表明該溶劑能提取比傳統(tǒng)溶劑極性范圍更廣的酚類(lèi)物質(zhì)。之后，Wei等[12]又用氯化膽堿-乳酸溶劑提取了黃芩中的4種主要的黃酮類(lèi)物質(zhì)，都獲得很好的提取率。Nam等[13]發(fā)現(xiàn)在槐花的黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取中，天然低共熔溶劑比傳統(tǒng)溶劑的提取效率更高，重要的是在黃酮類(lèi)物質(zhì)提取中其體現(xiàn)出了更高的生物活性。Radosevic等[14]也證明天然低共熔溶劑能提高植物提取物的生物活性。García等[15]從橄欖油中提取酚類(lèi)物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種環(huán)烯醚萜在天然低共熔溶劑的提取率相較于傳統(tǒng)溶劑分別提高了20%～33%和67.9%～68.3%。

本研究將天然低共熔溶劑應(yīng)用于提取油茶蒲中植物多酚的工藝中，以多酚得率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，以不同天然低共熔溶劑、液料比、提取溫度、提取時(shí)間等單因素試驗(yàn)為基本依據(jù)，通過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化天然低共熔溶劑提取油茶蒲中植物多酚的工藝條件，以期為開(kāi)發(fā)利用油茶蒲中植物多酚資源及其生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

油茶蒲，購(gòu)于江西贛州市上饒縣。挑選優(yōu)質(zhì)的油茶蒲，沖洗后于烘箱中烘干、粉碎后備用。

1.1.2 主要試劑與溶液配制

福林酚(Folin phenol)、檸檬酸、乙醇、蘋(píng)果酸、葡萄糖、沒(méi)食子酸、氯化膽堿、碳酸鈉等，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，均為國(guó)產(chǎn)分析純；蒸餾水。

體積分?jǐn)?shù)10%的福林酚溶液：吸取5 mL 福林酚至50 mL容量瓶中，定容。

質(zhì)量濃度7.5 g/100 mL的碳酸鈉溶液(室溫下可保存1個(gè)月)：稱(chēng)取(15.00±0.01)g碳酸鈉，加一定的蒸餾水溶解，移至200 mL容量瓶中，定容。

不同質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸溶液:參考GB/T 8313—2008。稱(chēng)取一定量沒(méi)食子酸置于燒杯中，加適量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，定容、搖勻，放置片刻后，分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL溶液于50 mL容量瓶中，定容、搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

BJ-500A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江德清拜杰電器有限公司；FA-B分析天平，上海精科精密科學(xué)儀器有限公司；722S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；DK-98ⅡA電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油茶蒲中多酚的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.25 g油茶蒲，裝入玻璃試管中，分別加入一定體積不同摩爾比的低共熔溶劑作為提取溶劑，將其放入一定溫度的恒溫水浴鍋中，提取一定時(shí)間后，取出過(guò)濾，對(duì)濾液進(jìn)行分析。

1.2.2 多酚含量測(cè)定及得率計(jì)算

待測(cè)液：將1.2.1的濾液取1.0 mL 于100 mL容量瓶中，定容、搖勻，待測(cè)。

參考林玉芳等[16]方法對(duì)多酚進(jìn)行測(cè)定。移取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、水和待測(cè)液各1.0 mL，并分別加入5.0 mL 10%的福林酚試劑，振動(dòng)，靜置3～8 min后加入4.0 mL 7.5 mg/100 mL碳酸鈉溶液，搖勻，常溫避光60 min后,以水為參比，置于分光光度計(jì)765 nm下測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)作曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.112 7x+0.028 9(R2=0.999 7)。

根據(jù)待測(cè)液的吸光度，按照下式計(jì)算多酚得率。

式中：A為待測(cè)液的吸光度；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；V為提取液的體積；d為稀釋倍數(shù)；kd為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；m為油茶蒲質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同提取溶劑對(duì)多酚得率的影響

提取溶劑對(duì)天然產(chǎn)物的提取效果有關(guān)鍵作用，本研究選擇了兩種有機(jī)酸和膽堿鹽按不同摩爾比組合形成的天然低共熔溶劑作為新型提取溶劑，并以傳統(tǒng)提取溶劑水和60%乙醇為對(duì)比，在液料比20∶1、提取溫度50℃、提取時(shí)間40 min條件下，考察不同提取溶劑對(duì)油茶蒲中多酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同提取溶劑對(duì)多酚得率的影響

由表1可知，天然低共熔溶劑組分的摩爾比對(duì)溶劑的提取效果有顯著影響，檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)和蘋(píng)果酸-氯化膽堿(摩爾比1∶2)的多酚得率分別達(dá)到0.763%和0.647%，明顯高于兩種傳統(tǒng)溶劑60%乙醇和水，而檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶2)和蘋(píng)果酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)的多酚得率則低于60%乙醇。因此，當(dāng)采用天然低共熔溶劑作為天然產(chǎn)物提取溶劑時(shí)，有必要考慮不同溶劑組分比例的影響。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在液料比20∶1、提取溫度50℃條件下，考察不同提取時(shí)間對(duì)油茶蒲中多酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

由圖1可見(jiàn)， 隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚得率明顯提高， 40 min達(dá)到最高值，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多酚得率沒(méi)有明顯變化。這主要是因?yàn)樵诓桓淖兤渌麠l件下，提取40 min已經(jīng)將多酚最大程度提取，多酚提取量達(dá)到了峰值，因此繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間并不能改變多酚得率。綜合考慮，在此提取條件下，提取時(shí)間范圍在30～50 min較為穩(wěn)妥。王翼等[17]在對(duì)合歡花中多酚進(jìn)行提取時(shí)，先通過(guò)石油醚脫脂，再用乙醇進(jìn)行提取，得出的最佳提取時(shí)間為1.0 h。由此可知，新型的天然低共熔溶劑作為提取溶劑能有效地縮短提取時(shí)間。

2.1.3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在液料比20∶1、提取時(shí)間40 min條件下，考察不同提取溫度對(duì)油茶蒲中多酚提取的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

由圖2可知，在本試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)，比較高的溫度和比較低的溫度都不利于多酚的提取。在低溫條件下，多酚得率較小，溫度升高，多酚得率也逐漸提高，在80℃時(shí)多酚得率達(dá)到了峰值，之后溫度繼續(xù)升高，多酚得率反而下降。這可能是因?yàn)楸容^高的溫度將一些存在于茶油蒲中的熱敏性的成分分解所致。馬永強(qiáng)等[18]在研究玉米芯植物多酚的提取工藝時(shí)，得出的有機(jī)溶劑最佳提取溫度為80℃。孫建[19]在研究荷葉中多酚的提取時(shí)，用乙醇有機(jī)溶劑的最佳提取溫度為65℃。由此考慮，本試驗(yàn)提取溫度范圍在70～90℃較為合理。

2.1.4 液料比對(duì)多酚得率的影響

以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)作為提取溶劑，在提取溫度80℃、提取時(shí)間40 min條件下，考察液料比對(duì)油茶蒲多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 液料比對(duì)多酚得率的影響

由圖3可知，隨液料比的增加，多酚得率升高，在液料比為40∶1時(shí)達(dá)到峰值，之后繼續(xù)增加液料比，多酚得率反而開(kāi)始明顯下降。姚永志等[20]用乙醇水溶液提取花生紅衣多酚，得出最佳提取料液比為1∶37.5，提取率達(dá)到7.9%。很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑和水的復(fù)合體系適合多酚物質(zhì)的提取，有機(jī)溶劑含量一般為50%～70%[21-23]。用低共熔溶劑提取的液料比大致與有機(jī)溶劑相似，出于成本和得率的考慮，液料比選取定在(30～50)∶1。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)為提取溶劑，以多酚得率為響應(yīng)值，以提取時(shí)間、提取溫度和液料比為影響因素，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。因素及水平見(jiàn)表2，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表2 因素及水平

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

表4 方差分析

注:**表示極顯著水平(P<0.01);*表示顯著水平(P<0.05)。

應(yīng)用Design Expert 8.0.6擬合表4中的數(shù)值，得到二次多項(xiàng)回歸模型：

根據(jù)分析，得出響應(yīng)值的最大預(yù)測(cè)值為0.934 2%，此時(shí)工藝條件為提取時(shí)間36.54 min、提取溫度80.67℃、液料比42.15∶1。為了方便實(shí)際操作，確定 提取工藝條件為提取時(shí)間37 min、提取溫度81℃、液料比42∶1，在此條件下對(duì)油茶蒲中多酚提取進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，平均多酚得率為0.932 1%，接近預(yù)測(cè)值。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)的水和60%乙醇溶液，發(fā)現(xiàn)天然低共熔溶劑對(duì)油茶蒲中的多酚具有更好的提取效果。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定天然低共熔溶劑提取油茶蒲中多酚的最優(yōu)條件為：提取溶劑檸檬酸-氯化膽堿(摩爾比1∶3)，提取時(shí)間37 min，提取溫度81℃，液料比42∶1。在最優(yōu)條件下，多酚得率為0.932 1%。