丁 坤， 曹文富, △， 張永越， 田 晟， 吳 慶

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科， 2中醫(yī)藥學(xué)院， 重慶 400016)

高尿酸血癥(hyperuricemia, HUA)是由于嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄減少導(dǎo)致的血尿酸水平升高。隨著人們生活水平的不斷提高，高尿酸血癥的發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，依據(jù)高尿酸的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)將其歸屬為“痛風(fēng)”、“歷節(jié)”和“熱痹”等疾病的范疇，其病機(jī)主要為“脾失健運(yùn)，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，痰瘀互結(jié)”。

高尿酸血癥可分為由尿酸鹽過(guò)量產(chǎn)生引起的“過(guò)度生產(chǎn)”類型，由尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)異常引起的“排泄不足”類型，以及兩者的組合[1]，不到10%的高尿酸血癥患者屬于過(guò)度生產(chǎn)型，黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致尿酸的過(guò)度生產(chǎn)；而超過(guò)90%的患者屬于排泄不足型[2]，因此，腎臟尿酸排泄不足被認(rèn)為是高尿酸血癥的主要原因[3]。

尿酸的排泄過(guò)程，除了濾過(guò)不需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與外，其余尿酸代謝過(guò)程均需要尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用[4]。越來(lái)越多的證據(jù)支持腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)腎臟尿酸排泄維持血尿酸平衡[5-8]。然而，目前臨床上治療高尿酸血癥的藥物非常有限，主要以XOD的抑制劑別嘌呤醇和促進(jìn)尿酸排泄的苯溴馬隆等藥物為主，這些藥物不良反應(yīng)多，患者耐受性差，影響了高尿酸血癥的治療。中藥多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)在高尿酸血癥的防治中具有一定優(yōu)勢(shì)，本研究所用祛濕滌濁湯(Qushi-Dizhuo decoction, QSDZ)為曹文富教授臨床治療高尿酸血癥及尿酸性腎病的經(jīng)驗(yàn)方。本研究采用腺嘌呤和氧嗪酸鉀聯(lián)合灌胃建立HUA模型，觀察祛濕滌濁湯對(duì)XOD和尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的調(diào)節(jié)以探討其防治機(jī)制，為本方在臨床上防治高尿酸血癥提供參考資料。

材 料 與 方 法

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房,動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0001。

1.2藥品及試劑 中藥飲片蒼術(shù)、威靈仙、土茯苓、萆薢、黃芩、秦皮、丹參和姜黃購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房(由重慶醫(yī)科大學(xué)曹文富教授鑒定合格)；腺嘌呤、氧嗪酸鉀和別嘌呤醇均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol、RR037A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix購(gòu)自TaKaRa；PCR引物由成都寶生生物公司合成；抗尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (urate transporter 1,URAT1), 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9 (glucose transporter 9,GLUT9), 有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(organic cation transporter 1,OCT1)和ATP結(jié)合盒亞家族G成員2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)抗體購(gòu)自Proteintech；抗有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 (organic anion transporter 1,OAT1)抗體購(gòu)自Abcam；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和蛋白Marker購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；大鼠尿酸(uric acid，UA)酶比色法試劑盒和肌酐(creatinine，Cr)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3儀器設(shè)備 低溫高速離心機(jī)(Sigma)；ELISAcalc 計(jì)算軟件、T100TMPCR儀和ThermoND超微量核酸蛋白測(cè)定儀(上海基因有限公司)；CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)、電泳儀及電泳槽(Bio-Rad)和BX熒光正置顯微鏡及CellSens Standard圖像采集軟件(OLYMPUS)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

2 方法

2.1高尿酸血癥大鼠模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量以腺嘌呤100 mg/kg、氧嗪酸鉀1 500 mg/kg的比例，二者混合后制成濃度為80 g/L的混懸液,每天進(jìn)行灌胃，連續(xù)28 d。

2.2藥物制備 祛濕滌濁湯各中藥飲片均按《中國(guó)藥典》(2015版)規(guī)定的臨床常用量使用，即：蒼術(shù)10 g、威靈仙10 g、土茯苓30 g、萆薢30 g、黃芩10 g、黃柏10 g、秦皮10 g、丹參10 g和姜黃10 g。各中藥飲片混合水提后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成含生藥2×103g/L的制劑，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。別嘌呤醇：別嘌呤醇用生理鹽水配成2 g/L的制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照(blank control)組、模型(model)組、別嘌呤醇(allopurinol)組、祛濕滌濁湯低、中和高劑量(QSDZ-low、QSDZ-middle和QSDZ-high)組，每組10只。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》體表面積折算法計(jì)算大鼠用藥劑量，成人體重以70 kg算，大鼠等效劑量為成人6.3倍，由此算出大鼠別嘌呤醇和祛濕滌濁湯的臨床等效劑量分別為27 mg/kg和11.7 g/kg，以臨床等效劑量的1倍、2倍及4倍設(shè)立祛濕滌濁湯低(11.7 g/kg)、中(23.4 g/kg)和高(46.8 g/kg)劑量。各組大鼠予相應(yīng)制劑灌胃，制劑間的體積差用生理鹽水補(bǔ)齊，空白對(duì)照組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。各組大鼠分籠喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間每日灌胃1次，自由飲水、進(jìn)食相同的標(biāo)準(zhǔn)飼料。

2.4標(biāo)本采集 灌胃4周并于末次灌胃后，禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥鈉以2.5 mL/kg的劑量腹腔注射麻醉大鼠，心臟取血，血清于-80 ℃保存，用于檢測(cè)血清尿酸和肌酐含量及黃嘌呤氧化酶活性。取雙側(cè)腎臟，部分腎組織放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，用于提取mRNA及蛋白，部分4%多聚甲醛固定。

2.5腎功能檢測(cè) 血清尿酸和肌酐水平及黃嘌呤氧化酶活性檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6腎組織形態(tài)學(xué)觀察 腎組織固定后，進(jìn)行乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、制成3 μm厚腎組織切片；按試劑說(shuō)明進(jìn)行HE染色，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。

2.7Real-time PCR TRIzol法提取總RNA，在37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s條件下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按如下條件進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析:ΔΔCt=(樣品Ct-內(nèi)參照Ct)-(實(shí)驗(yàn)Ct-對(duì)照Ct)，平均相對(duì)含量=2-averageΔΔCt×100%。引物信息見(jiàn)表1。

2.8Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA裂解液提取腎組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，用5×上樣緩沖液配平各蛋白樣品，上樣進(jìn)行SDS-PAGE。根據(jù)蛋白Marker位置切下目的蛋白所在的PAGE膠；將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加Ⅰ抗，置于4 ℃搖床中孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫下加Ⅱ抗孵育1 h，TBST洗膜5 min、3次?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀中顯影。目的蛋白與內(nèi)參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1 Real-time PCR 的引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 祛濕滌濁湯對(duì)高尿酸血癥大鼠血清UA和Cr含量及XOD活性的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組血清UA和Cr含量及XOD活性均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，QSDZ中、高劑量組血清UA和Cr含量及XOD活性較模型組顯著降低(P<0.05)；別嘌醇組血清UA含量和XOD活性較模型組顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 祛濕滌濁湯對(duì)高尿酸血癥大鼠血清UA和Cr含量及XOD活性的影響

Table 2. Effect of Qushi-Dizhuo decoction on the levels of serum UA, Cr and activity of XOD in hyperuricemia rats (Mean±SD.n=10)

GroupUA (μmol/L)Cr (μmol/L)XOD (U/L)Control89.52±11.0822.39±4.7324.51±3.97Model285.46±56.30#41.07±5.48#40.30±7.88#Allopurinol102.57±25.89?#32.73±6.4428.35±3.54?QSDZ-low202.23±29.3328.43±4.7135.34±2.72QSDZ-middle149.82±36.75?#27.37±3.52?30.94±3.07?QSDZ-high133.82±21.53?#25.83±6.38?27.73±3.36?

#P<0.05vscontrol group,*P<0.05vsmodel group.

2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

HE染色顯示空白對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)正常；模型組腎小球萎縮，腎小管擴(kuò)展，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；各藥物干預(yù)組較模型組腎臟病理?yè)p傷程度有所減輕，其中QSDZ中、高劑量組及別嘌呤醇組改善較明顯,見(jiàn)圖1。

Figure 1. Morphological changes of renal tissue in rats of each group.

圖1 各組大鼠腎組織形態(tài)變化

3 祛濕滌濁湯對(duì)腎組織URAT1、GLUT9、OAT1、ABCG2和OCT1蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組URAT1和GLUT9蛋白水平顯著升高(P<0.05)， OAT1，ABCG2和OCT1蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，祛濕滌濁湯中、高劑量組和別嘌呤醇組URAT1和GLUT9蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，OAT1、ABCG2和OCT1蛋白水平均顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

4 祛濕滌濁湯對(duì)腎組織URAT1、GLUT9、OAT1、ABCG2和OCT1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組URAT1和GLUT9的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)(P<0.05)， OAT1，ABCG2和OCT1 mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05);與模型組比較，祛濕滌濁湯中、高劑量組和別嘌呤醇組URAT1和GLUT9的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，OAT1，ABCG2和OCT1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

中醫(yī)認(rèn)為，先天腎氣不足，氣化和排泄水液功能減弱，后天又過(guò)食肥甘厚味，傷及脾胃，致水濕運(yùn)化失常，濕濁內(nèi)蘊(yùn)是高尿酸血癥的病理基礎(chǔ)[7]。本研究所用祛濕滌濁湯方中，蒼術(shù)苦燥化濕以防脾為濕困，燥濕健脾是為正治求本;威靈仙祛風(fēng)除濕，通絡(luò)止痛；土茯苓通利濕濁，通利關(guān)節(jié)，解濕熱閉阻關(guān)節(jié)之拘攣疼痛，聯(lián)合萆薢發(fā)揮利濕化濁、舒筋通絡(luò)的作用；黃芩、黃柏、秦皮清熱燥濕，瀉火除蒸，可直入血分以清熱血分之熱毒；丹參活血祛瘀以解血分之積聚，涼血消癰以解熱痹疼痛；姜黃活血行氣，祛風(fēng)除痹；因黃柏等苦寒易傷胃氣，配蒼術(shù)則暖胃以制之，諸藥合用以期改善高尿酸血癥“濕濁內(nèi)蘊(yùn)”的病理狀態(tài)，從而在一定程度上恢復(fù)腎組織結(jié)構(gòu)及功能。已有研究表明上述中藥或其有效成分可通過(guò)多種途徑對(duì)XOD和尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白產(chǎn)生影響，發(fā)揮降尿酸的作用[9-11]。

Figure 2. The protein expression of URAT1, GLUT9, OAT1, ABCG2 and OCT1 in renal tissues of the rats in each group. Mean±SD.n=10.#P<0.05vscontrol group,*P<0.05vsmodel group.

圖2 各組大鼠腎組織URAT1、GLUT9、OAT1、ABCG2和OCT1蛋白的表達(dá)

XOD是體內(nèi)嘌呤代謝中重要的酶，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化而生成UA。XOD的活性增強(qiáng)，可導(dǎo)致血UA的水平增高，長(zhǎng)期UA水平過(guò)高，會(huì)使UA在腎組織沉積而使腎小球?yàn)V過(guò)減少、Cr水平升高導(dǎo)致腎臟損害，成為尿酸性腎病[12]。本研究結(jié)果顯示，模型組XOD與正常組比較顯著升高，導(dǎo)致血UA和Cr水平升高，這與模型組HE染色顯示的腎臟病理?yè)p害相一致；祛濕滌濁湯中、高劑量組和別嘌呤醇組均能顯著降低高尿酸血癥大鼠的XOD，通過(guò)對(duì)該酶的抑制來(lái)降低UA和Cr水平，降低腎組織損傷，其中以祛濕滌濁湯高劑量組效果最為明顯。

高尿酸血癥主要是由于尿酸排泄減少所致，人體腎臟調(diào)節(jié)尿酸主要是通過(guò)腎小球?yàn)V過(guò)，再吸收，分泌和分泌后再吸收4個(gè)步驟完成，除濾過(guò)外均涉及各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。尿酸在近端小管被重新吸收的過(guò)程中，URAT1負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)陰離子與尿液中尿酸的交換[13]。GLUT9是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)治療高尿酸血癥的新靶點(diǎn)，與URAT1共同參與尿酸的重吸收，西藥中的丙磺舒，苯溴馬隆，氯沙坦等，以及與別嘌呤醇的復(fù)合制劑都能減少GLUT9的表達(dá)量，從而減少尿酸的重吸收過(guò)程，URAT1和GLUT9主要位于近端小管細(xì)胞的頂膜上，負(fù)責(zé)將濾過(guò)后的尿酸從腎小球?yàn)V液重新吸收回到血液中[14-15]。本研究中模型組URAT1和GLUT9蛋白及mRNA水平較正常組顯著上調(diào)，QSDZ干預(yù)后尿酸重吸收蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著下調(diào)，以QSDZ高劑量組下調(diào)最明顯，提示祛濕滌濁湯可通過(guò)抑制尿酸的重吸收來(lái)降低血UA。

Figure 3. The relative expression of URAT1, GLUT9, OAT1, ABCG2 and OCT1 mRNA in renal tissues of rats in each group. Mean±SD.n=10.#P<0.05vscontrol group,*P<0.05vsmodel group.

圖3 各組大鼠腎組織URAT1、GLUT9、OAT1、ABCG2和OCT1 mRNA的表達(dá)

尿液從血液到尿液的排泄必須通過(guò)腎臟近曲小管的2個(gè)壁，尿酸可通過(guò)位于腎小管細(xì)胞基底外側(cè)的OAT1利用由Na+-二羧酸鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白建立的外向二羧酸梯度以相同的交換方式從血液轉(zhuǎn)運(yùn)到腎小管細(xì)胞中[16]。研究顯示OAT1基因敲除的小鼠，其腎小球分泌尿酸鹽的能力明顯減弱[17]。此后，在ABCG2和OCT1的幫助下，尿酸從腎小管細(xì)胞分泌到近端小管[18]。ABCG2 是一種高容量尿酸分泌蛋白，人類中ABCG2突變被認(rèn)為是青年高尿酸血癥的主要原因，ABCG2 表達(dá)降低可使腸道排泄的尿酸減少，繼而使得腎臟的尿酸負(fù)荷增大[19]，研究表明OCT1的表達(dá)和功能的變化可以顯著影響二甲雙胍的藥代動(dòng)力學(xué)，影響其對(duì)2型糖尿病高尿酸血癥患者的療效[20]。本研究中模型組OAT1，ABCG2，OCT1蛋白及mRNA水平較正常組顯著下調(diào)，QSDZ干預(yù)后尿酸分泌蛋白表達(dá)及mRNA水平顯著上調(diào)，以QSDZ高劑量組上調(diào)最為明顯，提示祛濕滌濁湯可通過(guò)促進(jìn)尿酸的分泌來(lái)降低血UA。

另一方面，大部分分泌后尿酸在近端小管遠(yuǎn)端部分被URAT1再重新吸收，URAT1表達(dá)的上調(diào)會(huì)增強(qiáng)尿酸的重吸收，造成血尿酸水平的升高[14]，再次說(shuō)明URAT1對(duì)近曲小管重吸收尿酸具有重要意義，為促尿酸排泄藥物的重要靶點(diǎn)。這也與本研究中模型組URAT1表達(dá)上調(diào)相一致，說(shuō)明該模型可能是通過(guò)上調(diào)URAT1的表達(dá)，促進(jìn)尿酸的重吸收，從而使尿酸的排泄減少，導(dǎo)致血UA和Cr在體內(nèi)持續(xù)升高，形成尿酸性腎損傷。

本研究證實(shí)了祛濕滌濁湯能顯著降低高尿酸血癥大鼠尿酸水平，祛濕滌濁湯的降尿酸作用主要從2個(gè)方面來(lái)解釋。首先，降低XOD的活性，導(dǎo)致尿酸鹽的生成受到抑制；其次，呈劑量依賴性地下調(diào)腎臟中URAT1和GLUT9蛋白及mRNA水平，抑制尿酸的重吸收，上調(diào)OAT1，ABCG2和OCT1蛋白及mRNA水平促進(jìn)尿酸的分泌，增強(qiáng)尿酸的排泄。與此同時(shí)，祛濕滌濁湯通過(guò)調(diào)節(jié)這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)降低血UA和Cr水平，改善高尿酸血癥大鼠腎功能。綜上所述，祛濕滌濁湯具有抑制尿酸的生成和促進(jìn)尿酸的排泄的雙重作用。這些結(jié)果表示祛濕滌濁湯在治療高尿酸血癥方面具有一定優(yōu)勢(shì)，為臨床運(yùn)用祛濕滌濁湯治療高尿酸血癥及尿酸性腎損傷提供了依據(jù)。